中国肿瘤生物杂志
http ：//www．biother．org
Chin J Cancer Biother ，Apr．2016，Vol．23，No．2
DOI ：10．3872/j．issn．1007-385X．2016．02．005
·基础研究·
4'-甲醚-黄芩素对耐药性人绒毛膜癌的耐药逆转作用
李卓1，2，朱利2，张燕2，徐昌芬2，徐珊2
（1．西安医学院第一附属医院检验科，陕西西安710077；2．南京医科大
学基础医学院细胞生物学教研室，江苏南京210029）
［基金项目］陕西省教育厅专项科研计划项目（No．12JK0768）；江苏省高校自然科学基金资助项目（No．06KJB360067）。Project supported by the Special Scientific Ｒesearch from the Bureau of Educaton of Shaanxi Province （No．12JK0768），and the Natural Science Foundation of Highe
r Educa-tion of Jiangsu Province （No．06KJB360067）
［作者简介］李卓（1982－），
女，陕西延安人，博士，主要从事肿瘤生物方面的相关研究，E-mail ：lizhuo721@163．com ［通信作者］徐珊（XU Shan ，corresponding author ），
E-mail ：xushannjmu@126．com ［优先发表］http ：//www．cnki．net /kcms /detail /31．1725．Ｒ．20160331．2016．010．html
［摘
要］目的：研究4'-
甲醚-黄芩素（4'-methylether-scutellarein ，4'-M-S ）对耐药性人绒毛膜癌的体内耐药逆转作用并探讨其相关作用机制。方法：在BALB /c 裸鼠左侧腋窝皮下注射耐药性人绒毛膜癌细胞JAＲ/VP-16建立耐药性人绒毛膜癌裸鼠皮下移植瘤模型，瘤体直径至1．0cm 时，随机分为空白对照组、依托泊苷（etoposide ，VP16）化疗组、4'-M-S 组和4'-M-S +VP16联合组，每组10只荷瘤鼠。动态观测各组荷瘤鼠肿瘤生长情况，并记录存活时间。3周后，通过光镜、透射电镜观察移植瘤组织形态学改变，流式细胞术检测移植瘤细胞凋亡率的变化，用ＲT-PCＲ、Western blotting 检测并比较4
组移植瘤组织中多药耐药基因1（multidrug resistance 1，MDＲ1）mＲNA 、肺耐药相关蛋白（lung resistance-related protein ，LＲP ）mＲNA 及其产物P-糖蛋白（permeability-glycoprotein ，P-gp ）和LＲP 的表达情况。结果：3周后发现，4'-M-S 对耐药性人绒毛膜癌有一定的体内抑制作用，与VP16联合用药可使裸鼠移植瘤生长明显受抑，抑瘤率达48．21%，同时可减轻化疗毒性反应、明显改善荷瘤鼠生活质量，并显著延长其平均存活时间；与其他3组相比，4'-M-S +VP16联合组移植瘤细胞凋亡率显著升高（均P ＜0．05），移植瘤组织中MDＲ1mＲNA 、LＲP mＲNA 及其编码蛋白P-gp 和LＲP 表达水平均显著下降（均P ＜0.05）。结论：4'-M-S 能有效逆转人绒毛膜癌对化疗药物VP16的耐药性，其机制可能与4'-M-S 诱导细胞凋亡和下调耐药基因MDＲ1mＲNA 、
最好的月饼品牌排行榜LＲP mＲNA 及相应产物P-gp 和LＲP 的表达有关。［关键词］绒毛膜癌；多药耐药；裸鼠；多药耐药逆转；4'-甲醚-黄芩素；依托泊苷［中图分类号］Ｒ737．33；Ｒ730．5
［文献标识码］A
［文章编号］1007-
385X （2016）02-0182-06Ｒeversal effect of 4'-methylether-scutellarein on multidrug resistance of human choriocarcinoma
LI Zhuo 1，2
，ZHU Liqun 2，ZHANG Yan 2，XU Changfen 2，XU Shan 2（1．Department of Clinical Laboratory ，First Affilia-
ted Hospital of Xi ’an Medical University ，Xi ’an 710077，Shaanxi ，China ；2．Department of Cell Biology ，College of Basic Medical ，Nanjing Medical University ，Nanjing 210029，Jiangsu ，China ）
［Abstract ］Objective ：To evaluate the reversal effect of 4'-methylether-scutellarein （4'-M-S ）on multidrug resistance of human choriocarcinoma in vivo ，and investigate its mechanism．Methods ：Drug resistant human choriocarcinoma cells were subcutaneously injected into left armpits of BALB /c nude mice to construct the subcutaneous exnograft model．When diameter of the xenografts reached 1．0cm ，the mice were randomly divided into four groups with ten mice in each ，namely control grop ，etoposide （VP16）group ，4'-M-S group and 4'-M-S +VP16group．After the treatment for three weeks ，growths of the exnograft tumors were dynamically observed and survival times of the mice recorded in the various groups ，morphological changes of the tumor tissues were observed with optical and transmission electron microscopes and apoptosis rates of the exnograft cells detected with flow cytometry assay．Expression levels of MDＲ1mＲNA ，LＲP mＲNA and their coding proteins ，P-gp and LＲ，were detected and compared among the four groups
with ＲT-PCＲand Western blotting as-says respectively．Ｒesults ：After the treatments for three weeks ，it was found that 4'-M-S has somewhat inhibitory effect
·
281·
李卓，等．4'-甲醚-黄芩素对耐药性人绒毛膜癌的耐药逆转作用
on drug-resistant human choriocarcinoma in vivo ，4'-M-S +VP16could apparently inhibit growth of the exnograft tumors in the nude mice with inhibition rate of 48．21%．Meanwhile ，toxicity of the chemotherapy was reduced ，life quality of mice with the exnograft tumors obviously improved and their mean survival times significantly prolonged．In the 4'-M-S +VP16group ，apoptosis rate of the xenograft cells was significantly increased ，and expression levels of MDＲ1mＲNA ，LＲP mＲNA and their coding proteins ，P-gp and LＲ，in the exnograft tumors significantly decreased comparing with the other three groups （all P ＜0．05）．Conclusion ：4'-M-S could effectively reverse resistance of the human choriocarcinoma to the chemotherapy drug VP16，which might be related with 4'-M-S inducing apoptosis of the tumor cells and down-regula-ting expression of MDＲ1mＲNA ，LＲP mＲNA and their coding proteins ，P-gp and LＲ，in the exnograft tumors．［Key
words ］
choriocarcinoma ；multidrug resistance ；nude mice ；reversal of multidrug resistance ；4'-methylether-scutellarein （4'-M-S ）；etoposide
［Chin J Cancer Biother ，2016，23（2）：182-
187．DOI ：10．3872/j．issn．1007-385X．2016．02．005］肿瘤细胞对化疗药物产生多药耐药（multidrug
resistance ，MDＲ）是导致人绒毛膜癌化疗失败的主要原因。许多从天然药物中提取的化合物被证实具
有逆转肿瘤MDＲ的作用［1-8］，但现有研究大都限于体外细胞实验，而许多具有体外抑瘤效果的化合物
在动物体内的作用效应却并不理想［9］
。4'-甲醚-黄芩素（4'-methylether-scutellarein ，4'-M-S ）是本实验室从中药马鞭草有效部位中提取到的抗人绒毛膜癌
的有效单体成分，本课题组前期体外细胞实验已证实，
4'-M-S 对人绒毛膜癌依托泊苷（etoposide ，VP16）耐药细胞JAＲ/VP16具有显著的耐药逆转作用
［10-12］
。本研究以人绒毛膜癌多药耐药细胞JAＲ/VP16的移植瘤裸鼠模型为研究对象，进一步明确4'-M-S 联合VP16耐药性绒毛膜癌的体内协同作用，并从不同方面探讨其可能机制，以期为
今后4'-M-S 逆转肿瘤多药耐药的临床应用提供实验证据。1材料与方法
1．1植物传播种子的方法还有哪些二年级
主要材料和试剂
细胞株：人绒毛膜癌耐药细胞株JAＲ/VP16为
本室自建［11］
。
实验动物：BALB /c 裸鼠，
雌性，4 6周龄，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供［动物合格证编号：SCXK （京）2012-0001］，在无特定病原体（SPF ）环境下饲养。
4'-甲醚-黄芩素（4'-methylether-scutellarein ，4'-M-S ）：由江苏省中医药研究所提供，纯度为99%，4ħ保存。其结构式如下
：
主要试剂：总ＲNA 提取试剂TＲIzol 购自Invitrogen
公司，
ＲT-PCＲ试剂盒ＲNA PCＲKit （AMV ）Ver．3．0购自TaKaＲa 公司，鼠抗人P-糖蛋白（permeability-glycoprotein ，P-gp ）单克隆抗体和鼠抗人肺耐药相关蛋白（lung resistance-related protein ，LＲP ）单克隆抗体均购自NeoMarkers 公司，
HＲP 标记羊抗鼠二抗购自北京中山生物技术有限公司。
1．2建立耐药性人绒毛膜癌移植瘤裸鼠模型
红枫
收集对数生长期的JAＲ/VP16细胞悬液，以5.0ˑ106个/0．2ml 无菌条件下接种于裸鼠左侧腋窝皮下，瘤体直径达1．0cm 以上者认定为移植瘤模型构建成功［13］
。
1．3
动物分组及给药方式
待荷瘤裸鼠瘤体直径达1．0cm 时，使用随机数
字表法随机分为4组：空白对照组、
VP16化疗组、4'-M-S 组和4'-M-S +VP16联合用药组，每组10只
荷瘤鼠。
空白对照组：生理盐水0．2ml /（只·d ），腹腔注射，
每日一次，连续3周；VP16组：用生理盐水稀释VP16，按10mg /（kg ·d ）腹腔注射，每日
一次，连续5d ；4'-M-S 组：用生理盐水稀释4'-M-S ，按10mg /（kg ·d ）灌胃给药，每日一次，连续3
周；联合用药组：VP1610mg /（kg ·d ）+4'-M-S 10mg /（kg ·d ），给药途径及时间分别与各自单
独用药组相同。1．4
计算移植瘤体积
给药后各组动物每隔两日用游标卡尺测量瘤结节的长径（a ）和短径（b ），按椭球形体积公式（V =a ˑb 2/2）计算肿瘤体积并求各组平均值，并以时间为横坐标、肿瘤体积为纵坐标绘制移植瘤生长曲线图，同时比较各组的体积抑瘤率。抑瘤率（%）=（空白对照组移植瘤体积－组移植瘤体积）
/空白对照组移植瘤体积ˑ100%。
·
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中国肿瘤生物杂志，2016年4月，23（2）
1．5记录荷瘤裸鼠生存时间
记录并比较各组荷瘤鼠实验开始至死亡的生存天数。相对生存时间比率（T/C，%）=（处理组荷瘤鼠平均生存时间/空白对照组荷瘤鼠平均生存时间）ˑ100%。
1．6观察移植瘤组织形态学特征
给药3周后，每组以颈椎脱臼法随机处死4只荷瘤鼠，剥取移植瘤。10%中性甲醛溶液固定部分标本，常规石蜡切片，行H-E染，光学显微镜观察肿瘤组织形态结构；切取约1mmˑ1mmˑ1mm新鲜瘤组织，迅速以2．5%戊二醛固定，常规处理后，透射电镜观察肿瘤组织超微结构；另取部分标本快速冻存于液氮内待测。
1．7流式细胞术检测移植瘤细胞凋亡率
取4组新鲜瘤组织（各约200mg），生理盐水漂洗去除血渍和污物，搓网、离心，制成单细胞悬液并调整为1．0ˑ106/ml，预冷的75%乙醇固定，－20ħ过夜。离心弃上清，50μg/ml碘化丙锭（PI）4ħ避光染30min，流式细胞仪检测细胞凋亡率（%）。
1．8ＲT-PCＲ检测移植瘤组织内多药耐药基因MDＲ1mＲNA和LＲP mＲNA的表达
用TＲIzol一步法分别提取4组裸鼠移植瘤组织的总ＲNA，按照试剂盒说明书进行ＲT-PCＲ扩增，以β-actin作为内参。MDＲ1mＲNA（170bp）的上游引物序列为5'-TTCCTTCACCCAGGCAATGA-3'，下游引物序列为5'-TGGCATAGTCAGGAGCAAATGA-3'。LＲP mＲNA（400bp）的上游引物序列为5'-ATGTCA-CAGGGCAAGTTCG-3'，下游引物序列为5'-AACAC-CGCTGGGAGGTAC-3'。β-actin mＲNA（197bp）的上游引物序列为5'-GAAATCGTGCGTGACATTAA-3'，下游引物序列为5'-AAGGAAGGCTG-GAAGAGTG-3'。PCＲ反应条件：94ħ30s，54ħ（MDＲ1）或57ħ（LＲP）30s，72ħ1min，35个（MDＲ1）或30个（LＲP）循环，72ħ延伸1min。PCＲ产物经1．5%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶图像分析仪进行表达分析，以靶基因mＲNA灰度与内参基因β-actin灰度比值作为靶基因mＲNA相对表达量。1．9Western blotting检测P-gp和LＲP蛋白的表达取4组移植瘤组织（各约200mg），加蛋白裂解液，组织匀浆，高速低温离心（4ħ，14000ˑg，15 min）提取上清蛋白，按常规Western blotting实验步骤进行电泳、转膜，经封闭后加入相应的鼠抗人P-gp 或LＲP单克隆抗体（1ʒ1000）、HＲP标记羊抗鼠二抗（1ʒ1000），显。用Quantity One4．5．6软件、以惠州旅游景点
β-actin为内参进行定量分析，以目的蛋白灰度/β-actin灰度比值计算蛋白相对表达量。
1．10统计学处理
应用SPSS15．0软件进行统计学处理，计量资料以珋xʃs表示，两组以上数据比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间比较采用t检验，以P＜0．05表示差异有统计学意义。
2结果
2．1荷瘤鼠一般情况
接种肿瘤细胞8 10d后，接种部位陆续出现肿瘤结节，其后肿瘤体积增长较快，14d后肿瘤结节长径达1．0cm。分组给药后，VP16组荷瘤鼠随化疗进程出现拒食、消瘦、反应迟钝等化疗不良反应，个别伴有腹泻，随着恶病质的出现及进展，陆续死亡；4'-M-S组荷瘤鼠一般情况好于VP16组，表现反应敏捷，进食尚可；4'-M-S+VP16组荷瘤鼠初期曾一度出现化疗不良反应，但较VP16组轻，随后进食逐渐正常，动作活跃，体质量回升。
2．2移植瘤生长情况
从肿瘤生长曲线（图1）可见各组移植瘤体积随时间进展逐渐增大，空白对照组和单用VP16组移植瘤
生长明显快于另外2组。3周后VP16组移植瘤平均体积达（4．89ʃ0．62）cm3，与空白对照组（5．29ʃ0．59）cm3差异无统计学意义（P＞0.05），体积抑瘤率仅为7．45%；单用4'-M-S组移植瘤生长速度稍缓，平均体积（3．54ʃ0．40）cm3，抑瘤率33．00%，与对照组差异无统计学意义（P＞0.05）；而VP16+4'-M-S联合对肿瘤生长的抑制作用明显，瘤体增长最缓慢，瘤体平均体积为（2.74ʃ0.58）cm3，抑瘤率达48．21%，显著高于空白对照组和VP16组（P＜0．05），但与4'-M-S组相比无显著差异（P＞0．05）（表1）。
表1各方法对肿瘤体积及荷瘤鼠生存时间的影响（n=10）Tab．1Effects of different treatments on tumor volume
and survival time of the tumor-bearing mice（n=10）
Group
华业汉Tumor volume
（V/cm3）
Inhibition
rate（%）
Survival
time（t/d）
T/C
（%）Control5．29ʃ0．59－29．50ʃ2．08100
VP164．89ʃ0．627．4528．80ʃ2．3897．63
4'-M-S3．54ʃ0．4033．0035．10ʃ2．36118．98 4'-M-S+VP162．74ʃ0．58＊△48．2139．50ʃ3．62＊△133．90 *P＜0．05vs Control group，△P＜0．05vs VP16group
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李卓，等．4'-甲醚-黄芩素对耐药性人绒毛膜癌的耐药逆转作用
2．3
荷瘤鼠生存时间
空白对照组和VP16组荷瘤鼠的生存时间差异
无统计学意义（P ＞0．05）；4'-M-S 单独用药组荷瘤鼠生存时间延长了18．98%，但与对照组相比差异无统计学意义（P ＞0．05）；4'-M-S +VP16联合组荷瘤鼠生存时间延长了33．90%，显著高于空白
对照组和VP16组（P ＜0．05），但与4'-M-S 单独用药组比较无显著差异（P ＞0．05，表1）
。
图1
不同处理组移植瘤体积生长曲线
Fig．1
Growth curve of xenograft volume in different groups
*
P ＜0．05vs Control group ，
△
P ＜0．05vs VP16group
2．4
移植瘤组织细胞形态学表现
光学显微镜观察（图2）结果显示，空白对照组
移植瘤组织呈巢状或不规则团块状排列，细胞密集，可见多量新生血管；细胞大小不一，呈浸润性生长，核大、深染，核质比大，可见核分裂相。VP16组与空白对照组相似，细胞增生活跃，中心可见部分坏死灶。4'-M-S 组细胞出现皱缩，体积变小，细胞核固
缩、深染，瘤细胞所占比例减少。VP16+4'-M-S 联合用药组可见瘤细胞数量减少并进一步固缩，胞质
淡红，并见弥漫性坏死灶。透射电镜观察（图3）结果显示，空白对照组肿瘤胞质丰富，核大、不规则，核膜界清，染质分布均匀，核仁明显；VP16组与空白对照组相似；4'-M-S 组肿瘤细胞皱缩，形态不规则，内质网扩张，细胞核变形，部分核染质浓集，呈早期凋亡特征；4'-M-S +VP16组肿瘤胞质出现空泡化，内质网扩张，染质浓集成片状，沿核膜边缘排列，呈典型凋亡特征。2．5移植瘤细胞凋亡情况
空白对照组与VP16组肿瘤细胞凋亡率相近［
（17．45ʃ0．76）%vs （17．70ʃ0．72）%，P ＞0.05］；4'-M-S 组凋亡率为（22．36ʃ1．03）%，较空
白对照组及VP16组均有显著增加（均P ＜0．05）；
4'-M-S +VP16组肿瘤细胞凋亡率最高达（40．75ʃ1．09）%，与其他3组相比差异有统计学意义（均P ＜0．05）
。
图2H-E 染观察各组移植瘤组织的形态学特征（ˑ400）Fig．2
Morphological characteristics of xenograft tissues in different groups by H-E stain （ˑ400）
A ：Control group ；
B ：VP16group ；
C ：4'-M-S group ；
D ：4'-M-S +VP16
group
图3透射电镜观察各组移植瘤组织中细胞的超微结构特征（ˑ8000）Fig．3
Ultrastructural characteristics of
xenograft tissues in different groups by transmission electron microscope （ˑ8000）
A ：Control group ；
B ：VP16group ；
C ：4'-M-S group ；
D ：4'-M-S +VP16group
2．6
移植瘤组织MDＲ1mＲNA 、
LＲP mＲNA 的表达ＲT-PCＲ检测结果（图4）表明，在空白对照组与
VP16组中MDＲ1mＲNA 和LＲP mＲNA 均有较高表
达，分别达1．75ʃ0．05、
1．66ʃ0．05和1．64ʃ0．08、1．53ʃ0．13，而且两者在两组间相对表达强度相近（均P ＞0．05）。与空白对照组和VP16组相比，4'-M-S 组MDＲ1mＲNA （0．73ʃ0．01）和LＲP mＲNA
·
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中国肿瘤生物杂志，
2016年4月，23（2）（0．55ʃ0．01）表达均显著下降（均P ＜0.05）；4'-M-S +VP16联合组MDＲ1mＲNA （0．23ʃ0．01）和LＲP mＲNA （0．18ʃ0．02）的表达量下降更多（均P ＜
0.05）
。
图4ＲT-PCＲ法检测不同处理组移植瘤MDＲ1mＲNA 和LＲP mＲNA 的表达水平Fig．4
Expressions of MDＲ1mＲNA and LＲP
mＲNA in different groups by ＲT-PCＲM ：DNA marker ；1：Control group ；2：VP16group ；
3：4'-M-S group ；4：4'-M-S +VP16group
2．7
移植瘤组织P-gp 和LＲP 蛋白的表达Western blotting 检测结果（图5）显示，空白对
照组和VP16组中P-gp 和LＲP 蛋白均有较高表达。与空白对照组和VP16组相比，
4'-M-S 组P-gp （0．49ʃ0．11vs 1．03ʃ0．12、1．10ʃ0．12，均P ＜0．05）和LＲP （0．35ʃ0．08vs 0．93ʃ0．04、
0．71ʃ0．03，均P ＜0．05）相对表达量均明显降低，4'-M-S +VP16组P-gp （0．39ʃ0．07）和LＲP （0．11ʃ0．01）的相对表达量也明显降低（均P ＜0．05），且
联合用药作用较4'-
M-S 单药降低更为明显
。图5
不同处理组移植瘤组织耐药蛋白P-gp 和LＲP 的表达Fig．5
Expressions of P-gp and LＲP proteins in different groups by Western blotting 1：Control group ；2：VP16group ；3：4'-M-S group ；4：4'-M-S +VP16group
3讨论
肿瘤细胞产生MDＲ是导致化疗失败的重要原
因之一，寻和开发肿瘤MDＲ逆转剂是当前临床
和基础研究中的热点问题之一。作为我国国粹的中草药，因其具有诸多天然优势，是寻肿瘤MDＲ逆转剂的重要来源，正在受到越来越广泛的关注。4'-M-S 是本课题组从中药马鞭草中提取的一种单体成
分，在前期研究［11］中成功构建了JAＲ/VP16人绒毛
膜癌VP16耐药细胞株；采用4'-
海涛离婚M-S 联合VP16用药后，发现其体外对耐药细胞株具有明显的协同增
敏作用，对VP16的耐药逆转倍数为5．02，逆转率可
达81．19%
［10，12］
。为此，本研究进一步进行体内实验，结果表明，
（1）VP16组肿瘤体积抑制率仅为7．45%，表明VP16的疗效较差。同时，化疗毒性反应导致荷瘤鼠生活质量较差，加速了荷瘤鼠的死亡，该组荷瘤鼠生
存时间最短，仅为（28．80ʃ2．38）d 。（2）4'-M-S 组荷瘤鼠的进食、活动及生存状况均优于空白对照组
和VP16组，体积抑制率也提高至33．00%，表明4'-M-S 体内对耐药性绒毛膜癌有一定的疗效，并验证了其低毒的优点。（3）4'-M-S +VP16联合用药组观察到：联合可减轻VP16的化疗毒副作用，荷瘤鼠存活质量明显改善，平均存活时间达（39．50ʃ3.62）d ；而且联合用药使荷瘤鼠抑瘤率提高至48.21%，超过了两药单用抑瘤率之和。提示4'-M-S 和VP16联合作用，可能通过协同作用增强肿瘤对化疗药物的敏感性，逆转荷瘤鼠移植瘤对VP16的耐药性。此外，组织学观察及流式细胞术检测结果
与体外细胞实验结果基本一致，证实4'-M-S +VP16联合用药有较强的协同抗肿瘤效应，诱导肿瘤细胞
凋亡是原因之一。以上这些发现与前期体外试验得
到的结论相一致
［10，12］
。此外，肿瘤MDＲ的发生往往与P-gp 和LＲP 等蛋白过度表达有关。其中，
P-gp 是MDＲ1基因编码的跨膜糖蛋白，为ATP 依赖物“外排泵”，是肿
瘤MDＲ的产生机制［14-15］，研究［16-18］
发现，P-gp 的含量和细胞内药物的积聚量及耐药程度呈明显的相关
性。LＲP 是1993年由Scheper 等［19］
首先在一株无
P-gp 表达的多药物耐药的非小细胞肺癌细胞株中发现的一种与MDＲ有关的蛋白质，其介导的药物
耐受非常广泛，包括一些P-gp 不能介导的耐药
［20-21］
。基于此，本实验观察了4'-M-S 体内给药对肿瘤细胞耐药相关活性物质P-gp 和LＲP 表达的影响。结果表明：4'-M-S 单用及与VP16联用，均可显
著降低移植瘤组织中耐药基因MDＲ1及其产物P-gp 蛋白的表达，阻止化疗药物经细胞膜转运所致的细
胞内药物浓度降低，提高化疗药物的细胞毒性作用，干预MDＲ产生；同时可降低LＲP mＲNA 及其产物
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