陈倩倩，杜海涛，陈峥，李毅，万军
中国人民解放军总医院第二医学中心消化科，北京100853
【摘要】目的观察包被VCAM -1抗体(Ab-VCAM)能否改变骨髓间充质干细胞(BMSCs)的特性及增加迁移
率。方法
①利用骨片法贴壁培养小鼠BMSCs ；②利用抗体包被技术分两步将Ab-VCAM 附着于BMSCs ，第一步
将PPG 包被于BMSCs ，即PPG-MSC ，第二步将Ab-VCAM 包被于PPG-MSC ，即V-MSC ；③利用免疫荧光技术证实V-MSC 的成功构建；④观察未包被BMSCs (即MSC)及V-MSC 组BMSCs 的形态、生长曲线及多向分化潜能；⑤利用Transwell 迁移实验比较体外迁移率。结果
①选择浓度为100μg/mL 的PPG 以及1∶200的VCAM -1抗体浓度
进行包被的效果最佳；②MSC 组、PPG-MSC 组、V-MSC 组中绿荧光数目的数值分别为(2.25±1.71)个/视野、(24.75±7.63)个/视野、(66±5.72)个/视野，差异具有显著统计学意义(P <0.01)；③第四代BMSCs 均可见正常细胞形态、生长情况一致、均可被诱导成脂肪细胞及成骨细胞；④两组细胞均具有迁移特性，V-MSC 的迁移数量[(34.33±9.48)细胞/视野]多于MSC[(23±7.16)细胞/视野]，但差异无统计学意义(P >0.05)。结论利用抗体包被技术
成功地构建了Ab-VCAM -1靶向性干细胞，证实了抗体包被不影响BMSCs 的生物学特性，并强化了BMSCs 的迁移
特性，可用于下一步移植相关疾病。
【关键词】骨髓间充质干细胞；包被VCAM -1抗体；包被技术；迁移；靶向【中图分类号】R329.2+8
【文献标识码】A
【文章编号】1003—6350（2019）10—1225—05
In vitro study of coating VCAM-1antibody in promoting migration of bone marrow mesenchymal stem cells.CHEN Qian-qian,DU Hai-tao,CHEN Zheng,LI Yi,WAN Jun.Department of Gastroenterology,the Second Medical Center,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853,CHINA
【Abstract 】Objective
To observe whether coating VCAM -1antibody (Ab-VCAM)can alter the characteristics
of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs)and increase its migration rate.Methods ①Mice BMSCs were culti-vated from bone-adherent cells.②Ab-VCAM1was attached to BMSCs in two steps using antibody coating technique.The first step was to coat PPG in BMSCs,namely PPG-MSC.The second step was to package Ab-VCAM in PPG-MSC,namely V-MSC.③Successful construction of V-MSC was confirmed by immunofluorescence technique.④The morphol-ogy,growth curve and multi-directional differentiation potential of BMSCs were observed in uncoated BMSCs (MSC group)and V-MSC group.⑤In vitro mobility was compared using Transwell migration assay.Results
①PPG with aduhaitao
concentration of 100μg/mL and a VCAM -1antibody of 1∶200were selected for optimal coating.②The
number of green fluorescence in MSC group,PPG-MSC group and V-MSC group were respectively (2.25±1.71)cells/view,(24.75±7.63)cells/view and (66±5.72)cells/view (P <0.01).③The fourth generation of BMSCs showed normal cell morphology,uniform growth,and could be induced into adipocytes and osteoblasts.④Both groups of cells had migra-tion characteristics,and the number of migration of V-MSC group was (34.33±9.48)cells/view,which was more than (23±7.16)cells/view of MSC group (P >0.05).Conclusion
Ab-VCAM -1targeting stem cells were successfully con-structed by antibody coating technique,which confirmed that antibody coating does not affect the biological characteris-tics of BMSCs and enhanced the migration characteristics of BMSCs.This can be used for the next step of transplanta-tion to treat related diseases.
【Key words 】Bone marrow mesenchymal stem cells;anti-VCAM -1coating;Coating technique;Migration;Tar-geting treatment
·论著·
doi:10.3969/j.issn.1003-6350.2019.10.001
基金项目：国家自然科学基金(编号：81370503)通讯作者：万军，E-mail：wanjun301@126
骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal
stem cells ，BMSCs)是一类具有高度自我更新能力、多向分化潜能、低免疫原性及免疫调节等特性的细胞，是细胞移植免疫或炎症相关疾病的种子细胞之一[1-4]。目前经静脉移植的干细胞多滞留在血运丰富的器官(如心脏及肺脏等)，导致了到达病变局部的细胞数量有限[5]，故
寻求一种能够有效地将BMSCs 运输到病变局部的方法
成为了研究的热点。基于在靶向性中配体导向性技术的应用[6]，本实验利用抗体包被技术将血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhension molecule -1，VCAM -1)抗体包被于BMSCs 表面，通过配体与受体结合介导迁移这一机制以提高干细胞的靶向迁移潜能。
海南医学2019年5月第30卷第10
期
1材料与方法
1.1实验动物BALB/c小鼠，2~3周龄，雄性，SPF级，用于提取BMSCs，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
1.2主要实验试剂及仪器α-MEM培养基(Hy-clone公司)，0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA(Gibco公司)，顶级胎牛血清(FBS；Gibco公司)，小鼠胶原酶Ⅱ(Sigma公司)，油红-O(Sigma公司)；茜素红S(Sigma公司)；FITC-标记的抗小鼠CD45，PE-标记的抗小鼠CD11b，PE CyTM-标记的抗小鼠CD90，ALEXA-标记的抗小鼠CD105；棕榈酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(Sigma 公司)；PPG(Sigma公司)；FITC标记的山羊抗小鼠IgG(ZSGB-BIO公司)；FITC标记的山羊抗兔IgG(ZS-GB-BIO公司)；倒置相差荧光显微镜及照相系统(日本Olympus公司)；Transwell迁移系统(Corning公司)。
1.3小鼠骨髓MSCs的分离、培养具体步骤同前期实验[1-4]：(1)处死小鼠后消毒、分离四肢骨、剃净肌肉、冲洗骨髓腔；(2)将四肢骨剪成骨片，将其移入加入3mL含有双抗的α-MEM及1mg/mL(质量体积比)胶原酶Ⅱ的玻璃瓶中，在37°C恒温摇床上(200r/min)摇2h，中止消化并洗涤；(3)洗涤后，将5mL含10% FBS的α-MEM置于细胞培养箱中静置培养；(4)3d 后首次换液，不必除去骨片；(5)第6天进行首次传代；(6)此后，每2d换液，待贴壁细胞密度达85%左右后传代。
1.4构建Ab-VCAM1-MSC(V-MSC)具体步骤同前期实验[1-4]
1.4.1不同浓度的棕榈酸蛋白G(PPG)包被细胞
1.4.1.1酯化反应(1)PPG溶于PBS至终浓度为1mg/mL；10mg棕榈酸N-羟基琥珀酰亚胺酯溶于无水乙醇至终浓度为10mg/mL；棕榈酸N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液溶于PPG溶解液至终浓度为0.1mg/mL。
(2)标准曲线吸光度在280nm以下，将蛋白浓度调节至750μg/mL。(3)过滤器(0.22μm)滤过除菌，存于4℃备用。
1.4.1.2PPG包被步骤(1)BMSCs(第4代，P4)重悬于α-MEM，浓度调整至3×106/mL。(2)CM-Dil染：加入3μL CM-Dil工作液于含有1×106个cells的α-MEM中混匀，置于37℃恒温孵箱中5min→4℃冰箱中15min。(3)PPG按一定浓度梯度(0μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL及1000μg/mL的浓度)加入细胞悬液中，置于37℃恒温摇床(100r/min)上缓慢摇动10min。(4)每个浓度接种于96孔板的3个孔中(1×104细胞/孔)。(5)加入50μL FITC-山羊抗小鼠-IgG(100μg/mL)，后进行荧光观察并计数(随机取4个视野/每孔)，计算包被率=带绿的细胞/红细胞×100%，选定最佳的PPG浓度。
1.4.2VCAM-1抗体包被步骤(1)BMSCs(P4)重悬于α-MEM，浓度调整至3×106/mL。(2)CM-Dil染后重悬。(3)PPG(100μg/mL)加入BMSCs细胞悬液中，置于37℃恒温摇床(100r/min)上10min。(4)分别加入兔抗小鼠VCAM-1抗体(稀释浓度为1∶50、1∶100、1∶200、1∶500、1∶1000)，冰上孵育1h。(5)以每个浓度接种3个孔接种于24孔板(2×105细胞/孔)。
(6)每孔加入100μL的FITC-山羊抗兔-IgG(100μg/mL)，37℃恒温孵箱中孵育1h。(7)观察荧光并计数(随机取4个视野/每孔)，计算包被率=带绿的细胞/红细胞×100%，选定最佳的VCAM-1抗体稀释浓度，并此细胞记为V-MSC。
1.4.3MSC、PPG-MSC、V-MSC包被率比较实验(1)以PPG(100μg/mL)及VCAM-1抗体浓度(1∶200)重复以上步骤。(2)将未包被BMSCs、单纯包被PPG及包被VCAM-1抗体的BMSCs接种于24孔板(2×105cells/孔)。(3)标记荧光，观察并计数、比较。
1.5MSCV-MSC的生物学活性
1.5.1计数法测定两组BMSCs的生长曲线(1)取生长良好的MSC及V-MSC(P3)，制成单细胞悬液每个时间点接种于96孔板中3孔(1.0×104细胞/孔)。
(2)每天计数(第1~12天)，常规换液。(3)描绘生长曲线并比较。
1.5.2成脂诱导分化具体步骤同前期实验[1-4]：(1)取MSC及V-MSC(P4)接种于24孔板中2孔(5×104细胞/孔)。(2)加入成脂诱导体系，常规换液。(3)第10天进行油红O染，观察细胞内脂肪滴形成情况。
1.5.3成骨诱导分化具体步骤同前期实验[1-4]：(1)取MSC及V-MSC(P4)，接种于24孔板中2孔(5×104细胞/孔)。(2)次日更换为成骨诱导体系，常规换液。(3)第21天进行茜素红染，观察骨结节形成情况。
1.6MSC及V-MSC的体外迁移(1)采用孔径为8μm的Transwell小室。(2)将MSC及V-MSC撤血清饥饿12h。(3)消化、重悬后加入1%牛血清白蛋白(BSA)的无血清培养基。(4)细胞接种于上层小室内(2×105cells/mL)，下层小室中加入20%FBS的α-MEM 600μL。(5)细胞培养箱中培养10h后刮除膜上表面的细胞，将膜于多聚甲醛中室温固定15min。(6)加入0.5%结晶紫(500μL/孔)，染10min。(7)去ddH2O洗涤后显微镜下观察。
1.7统计学方法应用SPSS17.0统计学分析软件分析数据，计量资料以均数±标准差(x
-±s)表示，多组间数据比较采用单因素方差分析，两组间数据比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1不同浓度PPG包被的结果红标记的BMSCs上可见包被着绿荧光标记的PPG，随着PPG
周比利浓度的升高(图1A)；随着包被于BMSCs 上的PPG 越多，BMSCs 的黏附性亦增加(图1B)。由于黏附性增加会影响BMSCs 的迁移，故100μg/mL 浓度的PPG 效果最佳，可用于包被VCAM -1抗体。
2.2不同浓度VCAM -1抗体包被的结果红标记的BMSCs 上可见包被着VCAM -1抗体(图2A)，VCAM -1浓度为1∶50、1∶100、1∶200、1∶500及1∶1000的包被率分别为(94.46±2.44)%、(94.52±2.39)%、(94.34±1.77)%、(80.80±2.24)%及(69.79±6.03)%。VCAM -1抗体浓度的降低导致包被的VCAM -1抗体数量的减少(图2B)，故选择1∶200的VCAM -1
抗体浓度做下一步实验。
图1不同浓度PPG 包被的结果
注：A ，红荧光为CM-Dil 进行标记的细胞，细胞膜上的绿荧光为包被PPG 的细胞，箭头所示为PPG-MSC (×400)；B ，PPG
浓度梯度曲线。
图2不同浓度VCAM-1抗体包被的结果
注：A ，红荧光为CM-Dil 标记的细胞，细胞膜上的绿荧光为包被VCAM -1抗体的细胞(×200)；B ，VCAM -1抗体浓度梯度曲线。
蔡依林结婚2.3MSC 、PPG-MSC 及V-MSC 包被率比较MSC 、PPG-MSC 、V-MSC 组中可见绿荧光(图3A)，绿荧光数目的数值分别为(2.25±1.71)个/视野、(24.75±7.63)个/视野、(66±5.72)个/视野(P <0.01)，见图3B 。
2.4两组BMSCs 的生物活性比较
曾经那个少年没有一丝丝改变2.4.1形态学观察MSC 及V-MSC 组中的细胞形态一致呈长梭形及小三角形，排列呈放射状或束状(图4A 、4B)。包被于细胞表面的Ab-VCAM -1可因传代导致浓度降低。CM-Dil 标记的细胞在绿荧光激发
下发出与细胞膜轮廓一致的红荧光(图4C 、4D)。
2.4.2生长曲线两组细胞3d 后均进入快速生长期，第5~8天到达生长平台期，第9天后出现老化、死亡(图5)，且两组差异无统计学意义(P >0.05)。
2.4.3成脂诱导结果MSC 及V-MSC 组均在镜下可见红脂肪滴(图6)，VCAM -1抗体包被技术不能影响BMSCs 向脂肪细胞转化。
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2.4.4成骨诱导结果两组BMSCs 的纺锤形突起渐消失，且部分细胞聚集生长形成多层的骨结节，茜素红染后可见红磷酸盐沉积(图7)。VCAM -1抗体包被技术不能影响BMSCs 向骨细胞转化。
2.5Transwell 迁移实验结果MSC 组及V-MSC
组中的迁移的BMSCs 被结晶紫染为紫(图8A 、8B)，且具有明显的迁移特性。V-MSC 组[(34.33±9.48)细胞/视野]向含20%血清的培养基的迁移数量多于MSC 组[(23±7.16)细胞/视野]，但差异无统计学意义(P >0.05)，见图8C 。
3讨论
目前干细胞移植仍是难治性IBD 、神经系统疾病及自身免疫性疾病等的研究热点之一。而MSCs 再生修复及免疫特性的发挥与干细胞定向迁移至病变部位的数量密切相关。尽管病变组织局部可以通过改变微环境、分泌趋化因子及黏附分子，募集MSCs 定向迁移至该部位，但其向病变靶器官迁移率仍极低[7]。前期研究发现，经静脉移植BMSCs
TNBS
图3MSC 、PPG-MSC 、V-MSC 包被率
注：A ，三组MSC 绿荧光照片(×200)；B ，数量比较图，a
P <0.05
。
图4形态学观察MSC 及V-MSC 组细胞
注：A ，P4代MSC 呈克隆样生长(×200)；B ，P4代V-MSC 呈克隆样
生长(×200)；C 、D ，红荧光均匀分布于细胞膜及胞浆，细胞核不着(×200)；C 为MSC 组；D 为V-MSC
组。
图5MSC 及V-MSC
的生长曲线图
图6橙红的脂肪滴位于MSC 及V-MSC 的细胞内
(×400)
图7MSC 及V-MSC 组均可见红的骨结节
(×200)
图8
MSC 及V-MSC 组中Transwell 小室膜上均可见结晶紫染的BMSCs(×400)
注：A ，MSC 组；B ，V-MSC 组，C ，数量比较图。
诱导的急性结肠炎小鼠模型，BMSCs在病变肠道定植数量极少，限制了BMSCs在局部发挥再生修复及免疫调节作用[1-5]。故本实验成功构建了靶向性干细胞以提高BMSCs的定向迁移率，以改善不足并提高疗效。
VCAM-1及其受体人迟抗原(very late antigen，VLA-4)是一类细胞黏附分子对。本实验选取VCAM-1抗
体作为靶向因子，增加了BMSCs向局部损伤或炎症部位迁移的潜力。在干细胞移植炎症性或免疫性疾病过程中，体外培养的BMSCs由于表面不表达或低表达黏附分子VCAM-1及整合素VLA-4，无力对炎症或损伤部位中存在的大量趋化因子发出的诱导迁移信号做出相应反应，以致于其定向迁移率较低[8-9]。有研究表明通过TNF-α及IL-1β的刺激可使MSCs诱导性高表达VCAM-1[9]，并将此处理的MSCs用于心肌缺血，结果发现其可定向迁移至损伤部位的数量增多，并加快了受损心肌的修复。
抗体包被技术是一种利用双特异性抗体结合的方法将特定抗体包被于细胞表面的技术，包括2个步骤：第一利用脂化蛋白质-G(PPG)与BMSCs共孵育来构建PPG-MSCs；第二将前期产物与VCAM-1抗体共孵育来构建Ab-VCAM-1靶向性干细胞。本实验将VCAM-1抗体成功地包被于BMSCs表面。利用免疫荧光技术来计算细胞表面的荧光量，进而验证包被是否成功；利用细胞计数法描绘生长曲线，发现VCAM-1抗体包被不会影响干细胞的生长周期；通过成脂肪及成骨诱导，发现VCAM-1抗体包被不改变干细胞多项分化的特性。本实验证实了该方法不改变细胞原有的生物学特性，并且操作简单。但此方法的缺点是包被上的抗体数量会随着细胞传代而逐渐变少。这为利用VCAM-1抗体包被的BMSCs移植各种难治性疾病奠定了基础。
此外，本实验通过体外迁移实验证实了BMSCs及VCAM1-BMSCs均可向20%FBS迁移，说明了VCAM-1强化了BMSCs的迁移能力。其中VCAM-1与VLA-4的特异性结合发挥了重要作用。(1)在造血
干细胞或祖细胞黏附于骨髓基质细胞的过程中，VCAM-1/VLA-4发挥了部分介导迁移的作用[5]；
(2)VCAM-1/VLA-4可在病变局部参与免疫应答反应并改变炎症环境；两者特异性结合后可在特定条件下共同刺激活化的T淋巴细胞，增强具有抗原递呈作用的巨噬细胞的功能，进而引发T细胞介导的免疫效应[9-11]；(3)定向迁移至损伤及炎症部位的BMSCs可通过VCAM-1/VLA-4分子对完成与血管内皮细胞外基质间及细胞间的黏附，这就完成了定植于局部病变部位的过程[12-13]。这为采用Ab-VCAM-1靶向性BMSCs 开展炎症及免疫相关疾病的研究提供了理论依据，同时抗体包被技术亦可用于包被其他特异性抗体，以获得不同的特性来相关疾病。
参考文献
[1]陈倩倩，万军，阎丽，等.绿荧光蛋白小鼠骨髓间充质干细胞培养
及其示踪的可行性[J].军医进修学院学报,2012,33(5):506-508, 521.
[2]陈倩倩，万军，阎丽，等.小鼠骨髓间充质干细胞移植后在炎症性肠
病模型的定位[J].军医进修学院学报,2012,33(6):638-641.
[3]陈倩倩.CXCR-4基因转染联合VCAM-1抗体包被促MSCs归巢及
其对实验性IBD小鼠肠黏膜修复机制研究[D].北京：中国人民解放军总医院·解放军医学院,2015.
[4]陈峥.CXCR-4基因转染的BMMSCs对实验性IBD小鼠肠黏膜修
复机制研究[D].北京：中国人民解放军总医院·解放军医学院, 2015.
[5]CHEN QQ,WAN J,YAN L,et al.Mesenchymal stem cells alleviate
TNBS-induced colitis by modulating inflammatory and autoimmune responses[J].World J Gastroenterol,2013,19(29):4702-4717. [6]ANSBORO S,GREISER U,BARRY F,et al.Strategies for improved
targeting of therapeutic cells:implications for tissue repair[J].Eur Cell Mater,2012,23:310-318.
[7]XINARIS C,MORIGI M,BENEDETTI V,et al.A novel strategy to
enhance mesenchymal stem cell migration capacity and promote tis-sue repair in an injury specific fashion[J].Cell Transplant,2013,22
(3):423-436.
散打防守反击[8]LI Q,YU P,WANG W,et al.Gene expression profiles of various cyto-
kines in mesenchymal stem cells derived from umbilical cord tissue and bone marrow following infection with human cytomegalovirus [J].Cell Mol Biol Lett,2014;19(1):140-157.
[9]WANG CM,GUO Z,XIE YJ,et al.Co-treating mesenchymal stem
钱钟书的女儿cells with IL-1βand TNF-αincreases VCAM-1expression and im-proves post-ischemic myocardial function[J].Mol Med Rep,2014, 10(2):792-798.
[10]GHOBADI A,RETTIG MP,COOPER ML,et al.Bortezomib is a
rapid mobilizer of hematopoietic stem cells in mice via modulation of the VCAM-1/VLA-4axis[J].Blood,2014,124(17):2752-2754.
[11]KAUNDAL U,BAGAI U,RAKHA A.Immunomodulatory plasticity
of mesenchymal stem cells:a potential key to successful solid organ transplantation[J].J Transl Med,2018,16(1):31.
[12]SHERIFF L,ALANAZI A,WARD LSC,et al.Origin-specific adhe-
sive interactions of mesenchymal stem cells with platelets influence their behavior after infusion[J].Stem Cells,2018,36(7):1062-1074.
[13]CORRADETTI B,TARABALLI F,MARTINEZ JO,et al.Hyaluron-
ic acid coatings as a simple and efficient approach to improve MSC homing toward the site of inflammation[J].Sci Rep,2017,7(1): 7991.
(收稿日期：2019-01-25)
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