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张鑫瑜;刘特;刘志学;李宁丽
【摘 要】Objective:To study the pathogenic molecular mechanisms of enterovirus 71 and screen the anti-virus drug for it.Methods: The stool from a patient of hand-foot-mouth disease was diluted by phosphate buffer solution (PBS). After filtrated by 0.22μm filter, the suspends of stool water were inoculated into cell medium of Veto cell lines. The scanning electron microscope assay ,PCR and western blotting assay were used to analyze the cytopathic effect (CPE), which was induced by enterovirus 71. Besides, the cell proliferation inhibitor rates on Vero, which was induced by enterovirus 71 were tested. Results: The cytopathic effect on Vero cells was found on 48 hours, which were inoculated stool solution. The same CPE on Vero cells could also found in different three cell phases. The results of electron microscope assay indicated that a large number of virus were found congregated on the cytoplasm and nucleolus in infected group. Furthermore, the results of polymerase chain reaction (PCR) and western blotting revealed that the nucleic acid and protein of ente
rovirus 71 were enriched by these assay in the infected group, however, the positive antigens of enterovirus 71 were not found in the blank control Vero cell group. On the other hand, the result shown that enterovirus 71 could inhibit the proliferation and growth of Vero cells in vitro. Conclusions: We have isolated the human entrovirus 71 and signed it for EV71-Tj-100623.%目的:探讨手足口病病原体EV71病毒的分离方法.方法:取手足口病患儿的粪便,经磷酸盐缓冲液(PBS)稀释后用0.22 μm滤膜过滤,将悬液接种于Vero细胞.通过EV71病毒致细胞病变效应(CPE)分析、电镜分析、EV71病毒特异性核酸及蛋白的聚合酶链反应(PCR)及Western Blotting分析来鉴定病毒分离和致病效果.检测病毒悬液对于宿主细胞Vero增殖抑制的效果.结果:标本悬液接种Vero细胞48 h后出现CPE.收集感染细胞的培养基上清液,连续感染2次,均出现同样的CPE.电镜检测发现在感染组Vero细胞的细胞质和细胞核周围均有大量聚集的病毒颗粒.EV71特异性核酸RT-PCR检测证实,感染组Vero细胞中可以扩增出EV71病毒特异性的核酸条带.Western Blotting检测发现,在感染组细胞中有高表达EV71特异性抗原蛋白,而未感染组细胞不表达该病毒抗原.MTT检测结果显示,EV71病毒显著抑制宿主细胞Vero的体外增殖和生长,并且呈时间依赖性.结论:成功分离出人手足口病致微生物EV71病毒株(该EV71病毒株编号为EV71-Tj-100623).
【期刊名称】《中国临床医学》
【年(卷),期】2011(018)003
【总页数】4页(P275-278)
【关键词】手足口病;EV71病毒;病毒分离鉴定
【作 者】张鑫瑜;刘特;刘志学;李宁丽
【作者单位】上海交通大学医学院,上海,200025;上海交通大学医学院,上海,200025;同济大学生命科学与技术学院,上海,200029;同济大学生命科学与技术学院,上海,200029;上海交通大学医学院,上海,200025
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【中图分类】R446.9
手足口病(hand-foot-mouth Disease,HFMD)是一种急性传染病。它传播途径复杂、疫情控
汪小敏资料制难度大、临床表现复杂及早期识别和救治难度大[1]。HFMD多发于1～3岁的儿童,主要通过粪-口途径以及飞沫传播。该疾病对儿童的致死率较高,且传染性强、传播速度快,因此,容易在短时间集中爆发和流行,是一种危害人类健康较大的传染性疾病[2]。HFMD常见的病原微生物为肠道小RNA病毒属的 EV(EV71)、Cox 病毒(CoxA 组的 16 、4 、5、7、9、10型、Cox B组的2、5型)和埃可病毒的某些血清型。EV71病毒于1969年在美国首次从手足口病患儿的排泄物中分离得到,并于1972年被确认为是手足口病的主要病原体[3]。受EV 71病毒感染的患儿病情较重,且多伴发不等程度的脑炎、无菌性脑膜炎、肺水肿或肺出血、急性软瘫和心肌炎等并发症,EV71病毒引起重症病例的比例大,是引起患者病死的主要原因[4]。但至今尚无有效的疫苗和性的药物,因此,从患者体内分离致病病原体且进行体外药物筛选对于寻有效的物非常必要。本研究报告了通过体外接种和扩增的方法,从手足口病患者的粪便中分离出致病微生物,通过特异性核酸PCR和蛋白质检测证实,所分离得到的病原体为EV71病毒。
1 资料与方法
1.1 标本及主要试剂 收集2010年3月—2010年7月上海交通大学医学院附属新华医院收治的
临床诊断为手足口病患儿的粪便排泄物本共5份。非洲绿猴肾细胞Vero购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库。肠道病毒EV71的小鼠抗人单克隆抗体购自Millipore公司。DMEM细胞培养基、FBS胎牛血清等购自GIBCO公司。其余生化及有机试剂均购自中国国药集团化学试剂有限公司。
1.2 病毒分离培养 手足口病患儿的粪便用0.9%氯化钠液或PBS制成20%粪便悬液(即1 g粪便加5 mL PBS),充分混匀,4 500 r/min,离心20 min,取上清液经0.22μ滤膜过滤后,取200μL加入4 mL的DMEM 细胞培养液(内含FBS 10%、L-谷氨酰胺2 mmol/L、青霉素100 U/mL、链霉素 100 U/mL)中,接种于正常生长的Vero细胞(每孔细胞数为5×106个)。该细胞于37℃、5%CO2的细胞培养箱中进行培养。于接种24 h后用倒置显微镜每天观察细胞病变效应(CPE),详细记录与标本有关的所有细节(如实验编号、接种日期、细胞种类及传代数等)。如果此时出现CPE,可取100μL阳性分离物再传3代,继续观察;如果7 d之后没有出现CPE,那么盲传1代继续观察7 d。CPE的观察记录格式:0～25%的细胞出现CPE记录为“+”;25%～50%的细胞出现CPE记录为“++”;50%～75%的细胞出现CPE记录为“+++”;75%～100%的细胞出现CPE记录为“++++”。CPE达+++～++++时,收集病变细胞液,-20℃条件下保存作病毒鉴定。如培养阴性,可盲传2代,如仍无CPE出现,则定义为阴性。所有样本处理必须在P2级生物
黄家驹死亡时间安全实验室的生物安全柜中进行。
1.3 细胞超微结构及病毒颗粒的电镜检测 收集各组细胞,用2%的戊二醛固定后,立刻送至同济大学生命学院电子显微镜实验室进行后续的样品处理机电镜检测。
1.4 聚合酶链反应(PCR)扩增病毒核酸 收集各组细胞,按 TrIzol Reagent说明书的步骤抽提总RNA,并利用 Rever Tra Ace-αFirst Strand cDNA Synthesis Kit经RT-PCR生成cDNA。以各组cDNA作为模板,用 PCR仪(Eppendorf RealPlex4,Eppendorf Co.LTD)进行 RT-PCR,扩增产物以1%的Agrose Gel电泳进行观察。各样本重复3次。目标片段的扩增引物序列为 EV71-S-FP:5′-GCAGCCCAAAAGAACTTCAC-3′,EV71-A-RP:5′-ATTTCAGCAGCTTGGAGTGC-3′,PCR 产物长度226 bp,退火温度为45℃,扩增循环数为35。
1.5 蛋白质免疫印记杂交(Western Blotting)检测蛋白表达量 收集各组细胞,根据Western blotting Kit说明书中的步骤,抽提细胞的总蛋白,利用Lowry法测定总蛋白浓度,以每个泳道20μg浓度的蛋白样品上样,经30%变性SDS-PAGE电泳后,用半干电转化法将蛋白转移至PVDF膜上,经过封闭、一抗(稀释倍数:1:400)孵育、PBST洗脱、AP标记的二抗(稀释倍数:1:
500)孵育、PBST再洗脱等步骤后,ECL化学发光及X线片曝光,并且经定影显影处理,获得清晰条带。利用BandScan软件分析各条带的A值。
1.6 MTT法检测病毒对细胞的生长抑制 将各组Vero细胞接种于96孔细胞培养板中(密度为5×104),病毒感染组细胞中每孔加入20μL病毒悬液,而阴性对照组加入同体积的0.9%氯化钠液。各组细胞共同置于37℃,5%CO2环境中培养24 h、48 h、72 h和96 h。在检测前加入MTT 20μL(5 mg/L),继续培养4 h。离心去上清液且加入DMSO溶解沉淀。用酶标仪在490 nm处读取所对应的吸光度(OD490值),设立3个复孔,取其平均值。测得各孔吸光度数值,利用公式:(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%,计算出病毒对细胞的增值和生长抑制率。
1.7 统计学处理 所有数据以均数±标准差(¯x±s)表示,用SPSS 10.0统计软件进行方差分析(ANOVA)或独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。大四下学期可以考四六级吗
2 结 果
刘特2.1 手足口病患者粪便悬液致使宿主细胞出现显著的CPE 将手足口病患者粪便悬液加入到正常生长的Vero细胞后,常规培养7 d。当Vero细胞培养至48 h后,在倒置显微镜下可以发现,
接种了患者粪便悬液的Vero细胞出现了明显的CPE,其表现为细胞生长停滞,细胞胞体变圆皱缩,原本连接紧密的细胞落出现松散和分离,胞浆内的颗粒性物质增加且细胞折光度变差,有部分细胞贴壁能力变弱,最后自瓶底脱落悬浮于培养基中。而阴性对照组(接种0.9%氯化钠液)的Vero细胞状态良好,无CPE出现。感染组Vero细胞通过连续传代3次,均能在每一代排泄物接种组的细胞中到CPE,且该CPE为肠道病毒诱导的。因此,本研究推测在该细胞悬液中包含肠道病毒,见图1 A-b。
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