产品微生物检测方法
B1产品采集与样品处理
于同一批号的三个运输包装中至少抽取12个最小销售包装样品，1/4林夕经典歌词样品用于留样，另1/2样品（可就地封存）必要时用于复检。抽样的最小销售包装不应有破裂，检验前不得启开。
在100级净化条件下用无菌方法打开检测的至少3个包装，从每个包装中取样，准确称取10g±1g样品，剪碎后加入到200ml灭菌生理盐水中，充分混匀，得到生理盐水样液。液体产品用原液直接做样液。
B2细菌菌落总数与初始污染菌检测方法
本方法适用于产品除始污染菌与细菌菌落总数（以下统称为细菌菌落总数）检测。
B2.1操作步骤
待上述生理盐水样液自然沉降后取上小清液作菌落计数。共接种5个平皿，每个平皿中加入1mL样液，然后用冷却至45℃左右的熔化的营养琼脂培养基15-20ml倒入每个平皿内混合均匀。待琼脂凝固后翻转平皿置35℃±2℃培养46h后，计算平板上的菌落数。
B2.2结果报告
菌落呈片状生长的平板不宜采用；计数符合要求的平板上的菌落，按式（B1）计算结果：
林鹏个人资料 X1=A？K＼5……………….B1
式中：X1─细菌菌落总数，cfu／g或cfu／ml；
A─5块营养营养琼脂培养基平板上的细菌菌落总数；
K─稀释度。
当菌落数在100以内，按实有数报告，大于100时采用二位有效数字。
如果样品菌落总数超过本标准的规定，按B2.3进行复检和结果报告。
B2.3 复检方法
将留存的复检样品依前法复测2次，2次结果平均值都达到本标准的规定，则判定被检样品合格；其中有任何1次结果平均超过本标准规定，则判定被检样品不合格。
B3 大肠菌检测方法
B3.1 操作步骤
取样液5ml接种50mL乳糖胆盐发酵管，置35℃±2℃培养24h，如不产酸也不产气，则报告为大肠菌阴性。
如产酸产气，则划线接种伊红蓝琼脂平板，置35℃±2℃培养18-24h，观察平板上菌落形态。典型的大肠菌落为黑紫或红紫，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽，也有的呈紫黑，不带或略带金属光泽，或粉红，中心较深的菌落。
取疑似大肠菌落1-2个革兰氏染镜检，同时接种乳糖发酵管，置35℃±2℃培养24h，观察产气情况。
B3.2 结果报告
凡乳糖胆盐发酵管产酸产气，乳糖发酵管产酸产气，在伊红美蓝平板上有典型大肠菌落，革兰氏染为阴性无芽胞杆菌，可报告被检样品检出大肠杆菌。
B4 绿脓杆菌检测方法
B4.1操作步骤
取样液5ml，加入到50mlSCDLP培养液中，充分混匀，置35℃±2℃培养18
～24h。如有绿脓杆菌生长，培养液表面呈现一层薄菌膜，培养液常呈黄绿或蓝绿。从培养液的薄菌膜处取培养物，划线接种十六烷三甲基溴化琼脂平板，置35℃±2℃培养18-24h，观察菌落特征。绿脓杆菌在此培养基上生长良好，菌落扁平，边缘不整，菌落周围培养基略带粉红，其他菌不长。
取可疑菌落涂片作革兰氏染，镜检为革兰氏阴性菌者应进行下列试验：
氧化酶试验：取一小块洁净的白滤纸片放在灭菌平皿内，用无菌玻棒挑取可疑菌落涂在
绿脓菌素试验：取2-3个可疑菌落，分别接种在绿脓菌素测定用培养基斜面，35℃±2℃培养24h，加入氯甲烷3-5ml，充分振荡使培养物中可能存在的绿脓菌素溶解，待呈蓝时，用吸管到移到另一试管中并加入1mol/L类似摩登家庭的美剧的盐酸1mL，振荡后静置片刻。如上层出现粉红或紫红即为阳性，表示有绿脓菌素存在。
硝酸盐还原产气试验：挑取被检菌纯培养物接种在硝酸盐胨水培养基中，置35洗葡萄的方法℃±2℃培养24h，培养基小倒管中有气者即为阳性。
明胶液化试验：取可疑菌落纯培养物，穿刺接种在明胶培养基内，置35℃±2℃培养24h，取出放于4-10℃，如仍呈液态为阳性，凝固者为阴性。
42℃生长试验：挑取可疑培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，置42℃培养24-48h，有绿脓杆菌生长为阳性。
B4.2 结果报告
被检样品经增菌分离培养后，证实为革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿脓杆菌试验均为阳性者，即可报告被检样品检出绿脓杆菌。如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和42℃生长试验三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中检出绿脓杆菌。
B5 金黄葡萄球菌检测方法
B5.1 操作步骤
取样液5ml，加入到50mlSCDLP培养液中，充分混匀，置35℃±2℃培养24h。
自上述增菌液中取1-2接种环，划线接种在血琼脂培养基上，置35℃±2℃培养24-48h。在血琼脂平板上该菌菌落呈金黄，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，周围有溶血圈。
挑取典型菌落，涂片作革兰氏染镜检，金黄葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列成葡萄状，无芽胞与荚膜。镜检符合上述情况，应进行下列试验：
甘露醇发酵试验：玻片法：取清洁干燥载玻片，一端滴加一滴生理盐水，另一端滴加一滴兔血浆，挑取菌落分别与生理盐水和血浆混合，5min如血浆内出现团块或颗粒状凝块，而
盐水滴仍呈均匀混浊无凝固则为阳性，如两者均无凝固则为阴性。凡盐水滴与血浆滴均有凝固现象，再进行试管凝固酶试验；试管法：吸取1：4新鲜血浆0.5Ml，放灭攻小试管中，加入等量待共菌24h肉汤培养物0.5mL。混匀，放35℃±2℃温箱或水浴中，每半小时观察一次，24h之内呈现凝块即为阳性。同时以已知血浆凝固酶阳性和阴性菌株肉汤培养物各0.5mL作阳性与阴性对照。
B5.2 结果报告
凡在琼脂平板上有可疑菌落生长，镜检为革兰氏阳性葡萄球菌，并能发酵甘露醇产酸，血浆固酶试验阳性者，可报告被检样品检出金黄葡萄球菌。
B6 溶血性链球菌检测方法
B6.1 操作步骤
取样液5mL加入到50mL葡萄糖肉汤，35℃±2℃培养24h。
将培养物划线接种血琼脂平板，35℃±2℃培养24h观察菌落特征。溶血性链球菌在血平板
上为灰白，半透明或不透明，针尖状突起，表面光滑，边缘整齐，周围有无透明溶血圈。
挑取典型菌落作涂片革兰氏染镜检，应为革兰氏阳性，呈链状排列的球菌。镜检符合上述情况，应进行下列试验：
链激酶试验：吸取草酸钾血浆0.2mL（0.01g草酸钾加5mL兔血浆混匀，经离心沉淀，吸取上清液），加入0.8mL灭菌生理墁水，混合后再加入待检菌奥林匹克运动会的宗旨是什么24h肉汤培养物0.5mL和0.25%氯化钙0.25mL。混匀，放35℃±2℃水浴中，2min观察一次（一般10min内可凝固），待血浆凝固后继续观察并记录溶化时间。如2h内不溶化，继续放置24h观害人不浅 ，如凝块全部溶化为阳性，24h仍不溶化为阴性。
杆菌肽敏感试验：将被检菌菌液涂于血平板上，用灭菌镊子取每片含0.04单位杆菌肽的纸片放在平板表面上，同时以已知阳性菌株作对照，在35℃±2℃下放置18-24小时，有抑菌带者为阳性。
B6.2 结果报告
镜检革兰氏阳性链状排列球菌，血平板上呈现溶血圈，链激酶和杆菌肽试验阳性，可报告被检样品检出溶血性链球菌。
B7 真菌菌落总数检测方法
B7.1 操作步骤
待上述生理盐水样液自然沉降后取上清液作真菌计数，共接种5个平皿，每一个平皿中加入1ml样液，然后用冷却至45℃左右的熔化的沙氏琼脂培养基15-25ml倒入每个平皿内混合均匀，琼脂凝固后翻转平皿置25℃±2℃培养7天，分别于3、5、7天观察，计算平板上菌落数，如果发现菌落蔓延，以前一次的菌落计数为准。
B7.2 结果报告
菌落呈片状生产的平板不宜采用；计数符合要求的平板上的菌落，按式（B2）计算结果：
K
X2=B？--- ……………………………………（B2）
5
式中：X2………真菌菌落总数，cfu/g或cfu/ml；
B………5块沙氏琼脂培养基平板上的真菌菌落总数；
K………稀释度。
当菌落数在100以内，按实有数报告，大于100时采用二位有效数字。
如果样品菌落总数超过本标准的规定，按
B7.3进行复检和结果报告。
B7.3 复检方法
将留存的复检样品依前法复测2次，2次结果都达到本标准的规定，则判定被检样品合格，其中有任何1次结果超过本标准规定，则判定被检样品不合格。
B8 真菌定性检测方法
B8.1 操作步骤
取样液5ml加入到50ml沙氏培养基中，25℃±2℃培养7天，逐日观察有无真菌生长。
B8.2 结果报告
培养管混浊应转种沙氏培养基，证实有真菌生长，可报告被检样品检出真菌。
附录C
（标准的附录）
产品杀菌性能、抑菌性能与稳定性测试方法
C1 样品采集
为使样品具有良好的代表性，应于同一批号三个运输包装中至少随机抽取20件最小销售包装样品，其中5件留样，5件做抑菌或杀菌性能测试，10件做稳定性测试。
C2 试验菌与菌液制备
C2.1 试验菌
C2.1.1细菌：金黄葡萄菌（ATCC 6538）大肠杆菌（8099或ATRCC25922）。
C2.1.2酵母菌：白念球菌（ATCC 10231）
菌液制备：取菌株第3-14代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（18-24h），用5ml0.03mol\L磷酸盐缓冲液（以下简称PBS）洗下菌苔，使菌悬浮均匀后用上述PBS稀释至所需浓度。
耿乐的爷爷 C3 杀菌性能试验方法
该试验取样部位，根据被试产品生产者的说明而确定。
C3.1 中和剂鉴定试验
进行杀菌性能测试必须通过以下中和剂鉴定试验。
C3.1.1 试验分组
1） 染菌样片+5mLPBS
2） 染菌样片+5mL中和剂
3） 染菌对照片+5mL中和剂
4） 样片+5mL中和剂+染菌对照片
5） 染菌对照片+5mLPBS
6） 同批次PBS
7） 同批次中和剂
8） 同批次培养基
C3.1.2 评价规定
1） 第1组无试验菌，或仅有极少数试验菌菌落生长。
2）第2组有较第1组为多，但较第3、4、5组较少的试验菌生长，并符合要求。
3）第3、4、5组有相似量试验菌生长，并在1×104-9×104cfu/片之间,其组间菌落数误差率不超过15%。
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