收稿日期:2005-10-28
基金项目：延边大学科研项目(延大科合字&200’(第’0号)作者简介：曹
丽(1)*+-)，女，吉林九台人，讲师，硕士,(电话)0+’’,’2-+-28()./01234567856/9。
基因组:;<；的提取是进行=<>:(随机扩增多态性:;<；标记)分析的重要步骤，提取:;<；的质量好坏直接关系到试验的成败&1(。果树中含有大量酚类物质，由于酚氧化成醌后能与模板:;<；呈不可逆结合，从而影响引物与模板的结合，而且还严重降低Taq 酶活性&2(，往往导致扩增失败。梨叶片中富含单宁、多糖、素及酚类等次生物质，这些物质在:;<；提取过程中极易与:;<；结合，形成黏稠的复合物，使之既难以溶解，又易褐变，所提:;<；质量也不高，难以用于>?=扩增，限制了=<>：技术在梨属植物分子生物学研究上的应用&’(。我们通过适当改进的?@<A 改良法，所提:;<；的颜洁白，成功率高，经验证完全可用于=<>：反应中。
1材料与方法
1.1试验材料1B1B1供试品种
供试梨品种采自延边大学农学
院果树试验基地，所用材料编号、名称为:1B 延边谢花甜;2B 明月梨;’B 南果梨;+B 山梨;5B 早酥(苹果梨×身不知);-B 大梨(苹果梨×谢花甜);*B 身不知;8B 苹果梨;)B 尖把×苹果梨;10B 苹香(苹果梨×谢花甜);11B 朝鲜洋梨;12B 花盖梨。采样时间为200’年*月中旬，采集健康植株上的叶片，用保鲜袋封存后置于冰盒中，迅速带回实验室，去除主脉后用液氮研磨成粉末，将粉末移入50CD 离心管中，放入,*0℃的超低温冰箱中，保存备用。
1B1B2酶及主要试剂大部分试剂和10碱基引物
(EF7G19公司)购自华美公司北京分公司，氯仿、异
戊醇、异丙醇、酒精等均为国产分析纯试剂。
1B1B’溶液配制参考萨姆布鲁克H 等的方法&+(，略
有改动。
1.2
基因组总D%&提取
采用?@<A 改良法提取梨基因组:;<，具体步骤：称取’I 左右的样品粉末，用金属勺将粉末移至预冷的50CD 离心管中；加10CD 经-5℃预热的提取缓冲液，加1勺>J>(约1I ),200µD "-巯基乙醇(AKL )。-5℃恒温水浴锅中温浴25CM9；加入10CD 氯仿，来回颠倒混匀后,18℃下*000G ·CM9,1
离心5CM9，弃上清和下清；再次加入10CD -5℃预热的提取缓冲液，温浴’0CM9，不时轻轻转动离心管；加入10CD 氯仿，来回颠倒混匀后,18℃下
*000G ·CM9,1离心15CM9，取上清；加入0B-倍冰冻异丙醇，颠倒混匀，沉淀:;<；钩出:;<；沉淀，用*0N 酒精冲洗几次，将:;<；移至无菌的1B5CD 离心管中;:;<；自然风干后，加入适量@L 溶解充分
后，加+µD=90O7(10CI ·CD ,1),’*℃恒温箱中过夜，然后贮存于,20℃冰箱中保存备用。
1.’D%&模板质量检测
采用紫外分光光度计检测和电泳检测两种方
法。取150µD :;<；用@L 液稀释至’000µD ，在
PMQ0/RM S,’010紫外可见分光光度计上测定:;<
样品的E:2-0和E:280，以E:2-0TE:280比值检测核酸纯度，并计算:;<；原液浓度?。取10µD :;<；样品，以0B5倍@AL 作电泳缓冲液，在含0B5µI ·CD ,1溴化乙锭的0B*N 琼脂糖凝胶上恒压(电压视胶板大小而定)电泳2R ，停止电泳。用U:V,8000凝胶成
一种新的梨基因组:;<；提取方法及其应用
shmily是什么意思曹
丽，曲柏宏，王
成
(延边大学农学院，吉林龙井
1’’+00)
摘要：摸索出一种新的:;<；提取方法---
?@<A 改良法，从梨成熟叶片中提取到高质量、高纯度的:;<。同时，分析了模板:;<；和8;@>O 浓度、Taq :;<；聚合酶用量等对=<>：反应体系的影响，建立了
一套适合梨基因组=<>：分析的技术体系。
关键词::;<；提取方法；随机扩增多态性:;<；分子标记技术；梨中图分类号:W*81"V--1B2
文献标识码:<
文章编号:0+’)-811+#200-$0’-02*’,0’
第+5卷第’期200-年5月
湖北农业科学
H 547M A IGM/5.Q5G0.S /M79/7O
Vol-+5;1B’K03-,200-
像系统照相，检测DNA样品完整性，并用Lambda DNA/HindⅢMarker估计DNA片段的大小。
1.4$%&’反应体系的优化与扩增
青春有你melody歌词RAPD扩增反应在DB80240-33型PCR仪上进行，扩增程序为：预变性94℃、5min；变性94℃、1 min，退火36℃、1min，延伸72℃、2min，共50个循环;72℃最终延伸5min。
采用25µL体系进行RAPD扩增，其中含模板DNA20ng，引物10pmol,dNTP150µmol·L-1,MgCl2 1.5mmol·L-1,Taq DNA聚合酶1U,10倍反应缓冲液[包含500mmol KCl,100mmol Tris-HCl(pH9.0), 1.0%Triton X-100]2.5µL，以重蒸馏水补充至25µL。
在保持反应体系其他因素一致的条件下，对体系中模板DNA、引物、dNTP、MgCl2、Taq DNA聚合酶分别设置不同浓度梯度进行优化，确定最适值。
(结果与分析
(.1基因组’)%提取
预备试验中，我们发现褐变问题是梨总DNA 提取中最难解决的问题，采用常规的SDS法、CTAB 法提取基因组DNA，提取的DNA呈深褐、絮状沉淀，难以用TE重溶,DNA含量极低(OD260/OD280值为1.2～1.4)，无法用于进一步的分析。后来利用CTAB改良法成功地进行了梨成熟叶片的DNA提取，经紫外可见分光光度计检测，大部分DNA OD260/OD280在1.6～1.9之间，少数在1.4～1.6之间，一般认为,OD260/OD280为1.5以上即可进行RAPD分析。所提DNA易溶于TE中，经0.7%琼脂糖凝胶电泳检测,DNA呈较整齐的一条线，无严重的拖尾现象，长度均在23kb左右，电泳检测结果见图1。
图1部分梨基因组DNA的电泳检测结果(未去RNA)
(.($%&’分析优化反应体系的建立
对影响梨RAPD分析的各个影响因素设置梯度比较试验，包括DNA模板用量、随机引物用量、Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq DNA聚合酶用量，通过逐步优化，最终获得了清晰的、重复性好的扩增结果。2.2.1DNA浓度对RAPD扩增结果的影响试验设定了在25µL体系中加入DNA10、20、40、80、100、200ng6个浓度处理，结果表明，该浓度范围内均能产生清晰的带型，本试验确定的模板DNA 使用量为25µL体系中加入20ng。
2.2.2引物浓度对RAPD扩增结果的影响试验设定了5、10、15、20、40pmol·L-15个引物浓度处理，引物为OPA08，品种为苹果梨。结果表明，引物浓度为5、10、40pmol·L-1时，有谱带缺失现象，而15和20pmol·L-1时可产生较稳定清晰的扩增带型(图2a)，因此，本试验确定的引物浓度为15pmol·L-1。
2.2.3Mg2+浓度对RAPD扩增结果的影响试验设1.0、1.5、2.0、2.5、
3.0mmol·L-15个Mg2+浓度处理，引物为OPA08，品种为苹果梨。结果表明，在1.0 mmol·L-1浓度下无扩增产物，而在1.5、2.0mmol·L-1时，可产生较稳定、清晰、一致的扩增带型，而Mg2+浓度为2.5mmol·L-1时有谱带缺失现象(图2b)。因此，本试验确定的Mg2+使用浓度为1.5mmol·L-1。2.2.4dNTPs浓度对RAPD扩增结果的影响试验设50、100、150、200、300µmol·L-15个dNTPs浓度处理，引物为OPA18，品种为苹果梨。结果表明，该浓度范围内产生的带型基本一致，但50、100、300
µmol·L-1浓度下带淡而且较模糊，还有条带缺失现象，而150、200µmol·L-1时带型清晰、稳定(图3a)。说明dNTPs浓度过高、过低都不利于扩增,dNTPs 浓度过低不能提供足够量的底物，过高又与Taq DNA聚合酶竞争Mg2+，造成Taq DNA聚合酶活性降低。试验确定dNTPs使用浓度为150µmol·L-1。
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2.2.5Taq DNA聚合酶浓度对RAPD扩增结果的影响本试验设定了在25µL体系中加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5U的Taq DNA聚合酶5个浓度处理，引物为OPA18，品种为苹果梨。结果表明,0.5U的处理有谱带缺失现象,2.5U的处理带淡而且较模糊,1.0、1.5、2.0U的浓度处理基本上没有差异，均能扩增出稳定、清晰、一致的带型(图3b)，因此，本试验确定的酶量为25µL体系中加入1.0U Taq DNA聚合酶。
*讨论
李湘简介预备试验中，我们发现褐变问题是梨总DNA 提取中最难解决的问题，采用常规的SDS法[5]、CTAB法[6]提取基因组DNA，提取的DNA呈深褐、絮状沉淀，难以用TE重溶,DNA含量极低，无法用于进一步的分析。
正式试验采用CTAB改良法，用梨成熟叶片提取DNA，所得DNA纯度较高，产率较大，经电泳检测，所提样品DNA均未降解，这就有效地解决了
274湖北农业科学2006
年
a
b
图2
引物浓度(a)和MgCl 2浓度(b)对梨RAPD 分析的影响
修杰楷 贾静雯RAPD 扩增所需的高质量模板问题，为RAPD 技术
在梨研究上的广泛应用提供了借鉴。试验表明，本
方法还适用于葡萄、桃等植物的DNA 提取。
另外，在提取缓冲液中加BME ，一方面是防止
DNA 链断裂，使DNA 重聚成二聚体，起到保护作
用；另一方面是与溶液中游离氧结合，以防止游离氧氧化酚类和其他次生物质，避免出现显反应，起到抗氧化剂的作用[7]。
通过对影响梨RAPD 分析的各影响因素设置梯度比较试验，最终确定在25µL 反应体系中，各
参试物用量为:DNA 模板20ng 、随机引物15
pmol ·L -1、Mg 2+浓度1.5mmol ·L -1、dNTPs 浓度150
µmol ·L -1、Taq DNA 聚合酶1.0U 。
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RAPD 条件优选[J ].安徽农业大学学报,2003,30(2):178-181.[2]戴思兰，陈俊愉，高英孚，等.DNA 提取方法对9种菊属植物
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(Agricultural College of Yanbian UniversityS LongTing 133400,Jilin ,CUina)
AB5 r-1 C A neV DNA eWtraction metUod -improved CTAB metUod Vas found VUicU could eWtracted UigU -Xuality and UigU -purity DNA from ripe leaves of pears.MeanVUileSsome factors Vere optimiYedSsucU as tUe concentration of DNA as templateSdNTPs and usage of TaX DNA polymerase.A suitable reaction system for RAPD -PCR of pear genome Vas establisUed.
DeE word5F DNA eWtraction metUod ;RAPD ;pear
(责任编辑王珞)
a b
图3dNTPs 浓度(a )和Taq 酶(b )对梨RAPD 分析的影响
第3期275
泰国科学家发现稻米"致香"基因
泰国科学家马拉格近日宣布发现了稻米"致香"基因。马拉格说，香米包含有非正常的基因。以茉莉香米为例，在其基因图谱中有8个基因处于"停工"状态，这8个形同摆设的基因正是引发这种稻米散发茉莉花香味的最主要原因。稻米基因由约5000个基因组成，如将其他稻米基因组中处于相同位置的8个基因进行"人工破坏"，使其处于"停工"状态，从而达到改普通稻米为香稻米的目的。马拉格认为，通过相同的方法，普通玉米、小麦、豆子和椰子都可以得到人工改良。
摘自《科技信息报》
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曹丽等：一种新的梨基因组DNA 提取方法及其应用