第42卷第2期2021年5月
Vol.42,No.2
May,2021吉林师范大学学报(自然科学版)
Journal of Jilin Normal University(Natural Science Edition)
doi：10.16862/jki.issn1674-3873.2021.02.020
曹昆，高福泉，董佳伟，徐洪伟”
（吉林师范大学吉林省植物资源科学与绿生产重点实验室，吉林四平136000）
摘要：人参主要产于中国的东北和朝鲜半岛，因为其具有极高的药用价值而被认为是草药中最重要的植物.内生真菌是一种有趣的微生物，它和植物形成互惠共利的联系.不同的内生真菌能够根据寄主及所处的生态环境的不同而产生不同的代谢物质.此外，内生真菌还能够促进宿主种子的萌发、茎的生长和诱导宿主耐受生物和非生物胁迫.本实验从7个地点进行采样，一共分离获得107株人参内生菌.对其中的29株内
生菌进行ITS分子验证，比对后的结果表明主要的内生真菌是镰刀菌和木霉菌.另外还有冻土毛霉和艾米斯托克篮状菌.鉴于木霉菌的生防功能，平板对峙实验的结果表明，木霉菌能够抑制病原镰刀菌和韦状节抱霉的生长.这些实验结果表明人参拥有各种不同的内生真菌，这些内生真菌为新的生物活性的化合物的鉴定以及病原菌的生物防治提供了基础.
关键词：人参；内生真菌；生防
中图分类号:Q939文献标志码:A文章编号：1674-3873-（2021）02-012245
0引言
人参（Panax ginseng C.A.Meyer）属于五加科药用植物，具有两降三抗的药用功效，因其药用价值极高而为人们所推崇，也被人们称为中药之王•人参主要产于中国的东北地区和朝鲜半岛，并在中国的吉林省规模化种植［1］.人参的根腐病是造成人参减产和影响人参品质的最重要的因素之一，根腐病是土传病害，防治困难•常见的病原菌包括尖抱镰刀菌和腐皮镰刀菌•主要侵染人参的根茎部，初期表现不明显，中后期叶片逐渐萎蔫直至死亡［2］.
植物内生真菌是一类在整个或大部分的生命周期中，都与植物生活在一起，并且不对植物产生病害的一类真菌［3］.实际上，大多数的植物体内都含有内生真菌，内生真菌可以大体上分为两大类：麦角
菌科（C）和非麦角菌科（NC）内生真菌•前者是通过系统性种子传播的方式进行传播•后者还没有很好的分类，但大多数属于子囊菌门和担子菌门［3］.20世纪70年代植物内生菌在全世界范围内引起了科学家们的极大兴趣⑷，研究发现含有毒性生物碱和内生菌的植物对生物和非生物胁迫表现出抗性•例如在苇状羊茅植物体内发现麦角菌科的内生真菌，这种内生菌能够对取食苇状羊茅的牛产生毒性，从而对植物宿主起到保护作用⑷.M.Shoresh等［5］将暗适应条件下生长的拟南芥转移至强光环境下，植物的叶片由于强光带来的损伤而变成红，但是接种哈茨木霉T22的植株没有受到类似的损伤.
内生真菌在植物组织内部广泛存在，由于在其内部长期存在并与之共同进化，内生真菌和宿主形成了互利共生的关系•一些内生真菌能够协助宿主抵御病虫害，促进植物的生长和提高植物的抗逆性•人参作为中药之王，与之共生的内生真菌可能含有某些特殊的次生代谢物质，可用于医药领域的研究.病害是造成人参减产的重要因素，分离具有抗生作用的重要的内生菌，对于防治病害，也具有重要的意义.
收稿日期：2021-02（3
基金项目：中央引导地方科技资金项目（202002016JC）
第一作者简介：曹昆（1982—），男'吉林省延吉市人'讲师'博士•研究方向：植物分子生物学.
通讯作者：徐洪伟（1964—），男'吉林省公主岭市人'教授'博士'硕士生导师•研究方向：基因工程.
第2期曹昆，等：人参內生真菌的分离鉴定及其生防功能的初步验证123
2实验材料和方法
2.1实验材料
在7个地点(汪清县，棒槌园沟，海拔73m N43.19E130.28；抚松县池西区白溪林场，海拔885m N42.02E127.40；长白县十四道沟镇，海拔1191m N41.32E127.56；临江市四道沟镇岗头村，海拔817m N41.43E127.08；江源区正岔街道新开村，海拔627m N42.07E126.39；靖宇县龙泉镇侯家店村，海拔600m N42.25E126.38；靖宇县蒙江乡中华村，海拔585m N42.23E126.45)开展人参的采集工作，选取健康的人参植株•取材后立即低温保存，邮寄回实验室并开展工作•zia
2.2人参的表面灭菌
取人参的根和茎部位，用流水冲洗去掉表面的泥土•吸水纸去除表面的水.75%的乙醇消毒1min，无菌水冲洗3次，无菌滤纸将其表面的水分吸干.消毒液(V(次氯酸钠)：V(水)=1：8)浸泡处理15min，再用无菌水冲洗3次(最后一次冲洗的水用于涂平板做阴性对照)，无菌滤纸吸干水分•将根和茎切成1cm的小段平放在PDA培养基上培养•
2.3人参内生真菌的分离纯化
28弋培养3d，观察是否有菌落形成•有单菌落形成后，立即挑取到新的PDA培养基中进行纯化培养并保存菌种.
2.4DNA的提取
本实验采用SDS法提取真菌的基因组DNA，取0.2g菌丝液氮研磨成粉末，加入1mL裂解液(0.2mol/L Tris-HCL(pH8.0),50mmol/L EDTA,2%SDS,0.1mol/L NaCl),65T水浴30min，加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇，混匀并静置2min,10000g离心10min，取上清液加入到新的离心管中，加入等体积的氯仿再次抽提，混匀后静置2min,10000g离心10min.取上清液，加入等体积的异丙醇，混匀.室温放置10min,10000g离心10min，弃上清液.75%的乙醇洗涤沉淀,10000g离心5min，弃去乙 醇并用无菌风吹干，加入含RNA酶的水溶解沉淀获得所需的DNA.
2.5ITS扩增和比对
弓I物：ITS-1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')ITS-4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')对模板DNA进行扩增，反应条件为：预变性94T,5min；变性94T,30s，退火55T,30s，延伸72T,50s, 30个反应循环；延伸72T,10min.电泳并将扩增好的条带切下做胶回收，与T载体做酶联反应，转化，测序•将测序的结果与NCBI的数据库进行比对.
2.6平板对峙实验
在9cm的平板的两端，分别接种内生菌绿木霉和病原菌燕麦镰刀菌以及韦状节抱霉，观察菌落生长情况.
3实验结果
3.1内生菌的分离
我们将人参的根和茎段接种到PDA培养基上,3d后观察，外植体贴近培养基的一侧长出白的菌丝•但是作为阴性对照，涂布有最后一次洗涤外植体的水的培养基，并没有长出菌落•说明外植体周围的菌丝为人参内生真菌•共分离获得107株内生菌•我们对其进行形态学初步观察后，选取29株内生菌做进一步的分子检测.
3.2内生菌的分子鉴定
我们将29株真菌的测序结果在NCBI网站上进行序列比对，结果发现它们从属的层次上可以划分为4类：镰刀菌属、篮状菌属、木霉菌属和毛霉(见图1).镰刀菌属的数量最多达到14株，木霉属的为13株.镰刀菌中包括：芳香镰抱菌(FusariurnredoZens)、尖抱镰刀菌(Fusariurnoxysporurn)和腐皮镰刀菌(FusariurnsoZani).蓝状菌属包括一种菌为艾米斯托克篮状菌(TaZaromycesamestoZkiae).木霉菌属包括4个菌种，分别为哈茨木霉(T ricAodermaAarzianum)、勾状木霉(TricAodermaAamatum)、绿木霉
124吉林师范大学学报（自然科学版）第 42 卷（Frichoderma. ©iride ）和康宁木霉（Frichodermaboningii ）.毛霉包括一种为冻土毛霉（MucorhiemaZis ）.另 外，还有两株内生真菌在数据库中没有注释.
（A ）腐皮镰刀菌；（B ）绿木霉；（C ）芳香镰抱菌；（D ）冻土毛霉；（E ）尖抱镰刀菌；（F ）哈茨木霉
图1人参根和茎段分离得到的部分内生真菌
Fig. 1 Partial endophytic fungi obtained from the isolation of ginseng root and stem
3・3内生菌的生防功能
向PDA 培养基上分别接种内生菌绿木霉和燕麦镰刀菌以及韦状节抱霉，我们发现绿木霉的生 长不受限制，而两种病原菌的生长速率明显放缓，特别是韦状节抱霉的生长明显受到抑制（见图2）.这 说明绿木霉菌能够有效地抑制两种病原菌燕麦镰刀菌和韦状节抱霉的生长.
(b )I
傢木畫韦状节砲劃.I
K.丿严麦镰刀菌乞丫绿木霍（A ）绿木霉vs 燕麦镰刀菌；（B ）绿木霉vs 韦状节抱菌
图2平板对峙实验
Fig. 2 Plate confrontation experiment
4结果与讨论
真菌在解决世界农业问题方面扮演着重要的角.由于内生真菌长期存在于植物的组织中并与其 共同进化，因此一些内生真菌能够防治病虫害.例如印度梨形抱不仅能够增强宿主的抗病性，而且能够 提高宿主的生物量和对非生物胁迫的抗性⑶.本实验中，我们共分离获得107株菌株，根据菌落的形态 特征，对其中29株内生菌进行了 ITS 测序.并将结果进行了基因比对，可以把获得的菌种分为4个属: 镰刀菌属、篮状菌属、木霉菌属和毛霉.我们分离的菌株数量并不多，这一方面可能与吉林东部地区的气
第2期曹昆，等：人参內生真菌的分离鉴定及其生防功能的初步验证125
候条件有关，另一方面可能与我们对外植体的消毒的严谨度有关.
镰刀菌因其产生的分生抱子形似镰刀而取名为镰刀菌，又因其分类中的很多菌种属于致病菌而恶名昭彰•镰刀菌的传播方式分为两种，即垂直传播和水平传播•前者是由母代到子代的传播，后者通过外源侵入寄主的方式进行传播•镰刀菌中的植物病原菌侵入植物维管或导管组织后，常导致植物根系出现腐烂、叶片萎蔫和促进植物疯长的现象[6].本文通过分子鉴定获得的29株菌中，有14株菌属于镰刀菌属，在种上划分为芳香镰抱菌、尖抱镰刀菌和腐皮镰刀菌•这样的实验结果似乎与内生菌的对植物的益生作
用相悖，但上述菌种也不仅仅只包括一个种，也是复合种[7].而且并不是所有的镰刀菌都只能为植物带来病害，有些植物内生镰刀菌还可以成为生防菌，这些内生非致病菌通过竞争和生态位排斥的方式，对致病镰刀菌起到排斥作用•例如：铀ia等[8]分离获得3株内生木贼镰刀菌(Fusariumeguiseti)，单独施用时能显著地促进梨树的生长•和燕麦镰刀菌联合施用时，能显著地减少根部燕麦镰刀菌的定殖和根腐病的发生;N.Benhamou等[9]研究发现，植物内生菌尖抱镰刀菌Fo47通过抗菌和重寄生，以及诱导植物产生防御应答的方式，能够有效地对抗终极腐霉(PytAiumuZtimum)对黄瓜的致病危害;I.Iori等[10]试图从分子系统发育的角度来解析病原镰刀菌和非致病镰刀菌，但是二者的分子系统发育特征并没有明显的不同•镰刀菌的内生行为与它的生防菌的作用之间的关系也是研究的热点，同样值得从分子生物学的角度对其进行深入的挖掘.
木霉属于丝状子囊真菌属，是土壤中一种很常见的微生物•在热带土壤中，每克土壤中含有10~ 103个抱子•本文通过分子鉴定的方法共分离获得13株木霉内生菌，包括哈茨木霉、勾状木霉、康宁木霉和绿木霉•木霉定殖于单子叶或双子叶植物的根系上，根际中的木霉和次生代谢物质有利于植物的生长和对矿质元素的吸收.G.Harman等[11]研究发现，向豆科植物施加哈茨木霉T22，植物根系变得发达，产量增加到123%.D.L.Lindsey等[12]向无菌的番茄组培苗施加绿木霉，植物的株高和鲜重分别增加28%和8%.在矿质元素吸收方面，哈茨木霉T22能够溶解磷酸岩、Fe3+、Cu2+、Mn"+and Zn0•此夕卜，它还能够产生可溶性代谢物用于还原Fe3+和Cu2+生成Fe(I)-Na2-邻菲咯啉二磺酸和Cu(I)-Na2-2,
9-二甲基-4,7-联苯-1,10-菲咯-线二磺酸[13].这种螯合和还原作用增加了植物对土壤中的营养元素的吸收，从营养学的角度也就解释了木霉对植物生长的促进作用•在抵御非生物胁迫方面，木霉菌表现同样出•当培养基中的水势降低到-0.2~-0.3MPa时，种子的发芽率受到了显著影响•而施加哈茨木霉T22的种子在受到相同干旱胁迫条件下，仍然保持较高且均一的萌发率[14].此外，在生物胁迫方面，木霉通过霉菌寄生和激活宿主免疫应答的方式在植物抗病方面发挥着重要的作用.Harman研究发现：向植物喷施生防试剂哈茨木霉T22，能有效控制病原菌对叶面和果实侵害[11].在我们的研究中，平板对峙实验同样表明绿木霉对镰刀菌有抑制的作用.
和前面两种真菌相比，有关冻土毛霉在植物中的研究相对较少.A.H.Molla和H.I.Khan研究发现：冻土毛霉可用于污水处理，经冻土毛霉和哈茨木霉处理的污水，水质得到了明显的净化,83%~100%的金属离子被过滤去除•使用污水直接浸泡种子，萌发率最高为30%.而经过冻土毛霉和哈茨木霉净化后的污水，种子萌发率为100%[15].因此冻土毛霉有螯合金属离子的功效•D.B.Wietse等[16]研究发现，向植物的根部接种冻土毛霉BHB1和哈茨木霉PvdG2够改变根际周围的细菌落结构•这些新增加的细菌一方面能够产生几丁质酶对抗病原菌，另一方面与病原菌竞争根系分泌物和空间，使病原菌处于“饥饿”的状态•因此冻土毛霉同样有对抗病原菌的功效.以上的实验结果表明：无论是我们分离得到的镰刀菌，还是木霉或冻土毛霉都有潜力成为人参的生防菌，为人参的抗病研究做有益的探索.
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Isolation and identification of endophytic fungi in ginseng
and preliminary verification of its biocontrol function
CAO Kun,GAO Fun-guan,DONG Jia-wei,^ong-wei
(Jilin Provioncial Key Laboratory of Plant Resources Science and Green Production,Jilin Normal University,Siping13600,China)
Abstract:Ginseng has extremely high medicinal value,mainly produced in Northeast China and the Korean Peninsula,and is considered to be the most precious plant among herbs.Endophytic fungus is an interesting microorganism,and it forms a mutually beneficial relationship with plants.Many endophytes brought benefits to their host plants.Due to the different host and the ecological environment in which they depended,various endophytes can produce different metabolites.In addition,endophytes can benefit their host in different ways, such as promoting germination and boosting their growth,inducing host plants to tolerate biotic or abiotic stress.In this experiment,samples were taken from7locations and a total of107strains of ginseng endophytes were isolated.Fusarium and Frichoderma were idetified as dominant endophytic fungi based on morphological traits and ITS sequences from29strains of endophytes.In addition to these two kinds of fungi,the ITS sequence alignment also revealed that MucorhiemaZis and Falaromycesamestolkiae exist in our interested fungus.Plate confrontation experiment shows that Frichoderma.viride can inhibit the growth of Fusarium avenaceum and Arthrobacter reedi/ormis.The results suggested that ginseng harbors diversified endophytic fungi that would provide a basis for the identification of new bioactive compounds,and for effective biocontrol of ginseng root rot.
Key words：ginseng；endophytic fungi；biological control
（责任编辑：林险峰）
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