生长前期三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)附肢再生系统解析及阶段划分
付媛媛;刘磊;母昌考;朱芳;任志明;李荣华;宋微微;王春琳
【摘 要】以三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期幼蟹为材料,采用组织切片等方法研究其大螯断肢后再生生长规律.结果表明,第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期幼蟹大螯一次蜕壳再生率分别为59.9％,75.3％,74.2％,80.4％,69.5％;断肢组存活率分别为89.4％,84.9％,85.2％,89.4％和74.2％,均低于对照组的98.2％,90.3％,95.1％,90.2％和80.3％,但差异不显著(P＞0.05);第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期断肢组在去大螯后平均蜕壳周期分别为3.33d、4.47d和6.27d,显著长于正常组的2.13d、3.89d和5.63d) (P＜0.05),而第Ⅳ、Ⅴ期断肢组平均蜕壳周期分别为7.12d和10.86d,极显著长于对照组的6.11d和8.09d (P＜0.01),且断肢个体的生长期越往后,断肢再生所需时间越长.本研究依据再生附肢发育特点将三疣梭子蟹大螯断肢再生划分为6个标志性发育阶段:再生芽基期、肢芽趾缝期、肢芽分化期、肢芽斑点期、肢芽成熟期、肢体出膜期;第1、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期蟹再生肢芽横纵比平均值分别达到0.32、0.318、0.398、0.518、0.538时,断肢幼蟹可以达到附肢出膜的临界点.综上所述,三疣梭子蟹断肢后能在1个蜕壳周期内完成大螯再生,第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期断肢幼蟹蜕壳周期时间显著
高于正常幼蟹;断肢组成活率低于对照组,但差异不显著,第Ⅳ期幼蟹的再生率和存活率均最高;各期幼蟹断肢再生附肢均经过6个具有标志性事件的发育阶段;各期再生肢芽横纵比值具有一定临界值(0.32,0.318,0.398,0.518,0.538).本研究首次对三疣梭子蟹断肢再生过程及再生能力进行了探究,结果将有助于甲壳类断肢再生机理的阐明.%Limb regeneration mechanism ofPortunus trituberculatus in different growth stages (Ⅰ to Ⅴ) was studied with histological sections.The results indicate that the limb regeneration rate after the first molt for stages Ⅰ to Ⅴ was 59.9％,75.3％,74.2％,80.4％,69.5％,respectively.The survival rate of limb (89.4％,84.9％,85.2％,89.4％,and 74.2％,respectively) was lower than that of the control group (98.2％,90.3％,95.1％,90.2％,and 80.3％,respectively),insignificantly.The average molting days of limb regeneration group for stages Ⅰ,to Ⅲ was 3.33,4.47,and 6.27d,respectively,which is significantly longer than the control group's (P＜0.05).However,the average molting days of stages Ⅳ and Ⅴ was 7.12 and 10.86d,which is significantly longer than the control group's (P＜0.01).For crabs in stage Ⅳ,six landmark developmental stages can be ,regeneration of bud base,limb bud toe seam,limb bud differentiation stage,limb bud spots,limb bud maturity,and molt regeneratio
n.The regeneration could succeed when average ratio of spine buds for these five stages reached 0.32,0.38,0.39,0.518,and 0.538.Totally,large chelating regeneration could be completed in a molting cycle.The molting cycle of the larvae in stages Ⅰ to Ⅴ were significantly longer than those of normal crabs.Both the regeneration rate and survival rate of the first-stage crab were the highest.The regeneration could be completed after all the six landmark developmental stages and the average ratio of spine buds must reach a certain critical value.Therefore,the limb regeneration mechanism ituberculatus may enrich our knowledge for crustacean aquaculture industries.
【期刊名称】《海洋与湖沼》
【年(卷),期】2017(048)005
【总页数】8页(P1084-1091)
【关键词】三疣梭子蟹;断肢再生;蜕壳周期;发育;再生肢芽比值
【作 者】付媛媛;刘磊;母昌考;朱芳;任志明;李荣华;宋微微;王春琳
【作者单位】宁波大学应用海洋生物学教育部重点实验室 宁波315211;浙江海洋高效健康养殖协同创新中心 宁波315211
【正文语种】中 文
【中图分类】S917;Q344
断肢再生是动物肢体损坏、自然脱落或者自残之后全部或部分重新生成的现象,是动物的一种自我保护机制(Mattoni et al,2015),多种动物均存在断肢再生的现象(Wilkie,2001;Konstantinides et al,2014;Shibata et al,2016)。已有研究表明,甲壳类,尤其是蟹类在断肢后具有较强的再生能力,且激素、温度、光周期等环境因素对蟹类断肢再生有较大的影响(Mykles,2001;Gong et al,2015;岳武成等,2016),但相关研究主要集中在统计学分析和生理现象描述层面,关于蟹类断肢及再生生理基础及再生生长能力的研究较少。Hopkins(1993)对招潮蟹(Uca pugilator)附肢再生过程进行了研究,描述了断肢再生肢芽原基的形成及基底的发育阶段。同时,动物再生能力及机制研究一直是生物医学研究热点,相关研究集中在小鼠、果蝇、斑马鱼、蝾螈(Bhaja et al,2010;张卓航等,2012)等模式动物上,研究结果可供人类再生医学研究参考。因此,建立甲壳类断肢再生动物研究模板,开展甲壳类断肢
再生机制研究对于再生生物学、再生医学、及甲壳类养殖都具有重要意义。
三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)味鲜美,营养丰富,是我国的重要经济蟹类(薛俊增等,1997;陈晨等,2015),2015年海水养殖产量近12万吨(农业部渔业局,2016)。然而,在三疣梭子蟹苗种培育、养殖、运输过程中存在因蟹互相攻击及其它物理损伤造成的附肢断肢现象,影响了蟹的摄食和运动能力,且断肢处易发生感染,造成蟹的成活率和养殖产量下降,经济损失巨大,因此断肢个体能否成功再生出附肢对提高三疣梭子蟹存活率和经济效益具有重要作用。目前,关于三疣梭子蟹断肢再生的报道极少,对不同生长期三疣梭子蟹的断肢再生生理学和再生能力的研究也尚未见报道。因此,针对三疣梭子蟹断肢再生生理过程及能力的认识和研究具有重要的基础及应用意义。
本研究应用人工外力断肢法将不同生长期的蟹断肢后,研究其附肢再生和发育能力,并采用组织切片法观察再生肢的发育状态,研究结果将为进一步探究三疣梭子蟹及其它甲壳类断肢再生机制提供基础数据和理论参考。
取同一家系的三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)Ⅰ期幼蟹5000只,饲养于6000升循环水养殖池中作为实验材料。海水盐度控制在25,温度28℃,然后根据图1方法进行分组,其中对断肢
组采用压力法迫使其自切掉其 1只大螯(左右随机),每天早晚各投喂1次饲料,每3天换水1次,试验期间各个水族箱的养殖环境保持一致。期间观察记录蜕壳和再生肢发育情况,统计记录蟹蜕皮、附肢再生和存活数。每12h观察各期幼蟹断肢肢芽的发育情况,并拍照记录,统计各生长时期螃蟹附肢再生的时间。平均蜕壳周期定义为三疣梭子蟹所有个体完成一次蜕壳所经历的平均天数。断肢再生率=再生出完整附肢幼蟹数/断肢幼蟹总数;存活率=实验组幼蟹存活数/饲养总数;第一次蜕壳未生附肢率=蜕壳未再生附肢存活的幼蟹数/断肢幼蟹总数。
梭子蟹蒸多久最佳时间试验期间,另取Ⅳ期幼蟹50只随机断掉其1只大螯,分别单独放养在50个长13cm*宽7cm*高7cm的孵化盒里,每天早晚各投喂1次饲料,每3天换水1次,试验期间各个孵化盒的养殖环境保持一致,分别于断肢后第1d,2d,3d,4d,5d各取5只幼蟹,置于解剖显微镜(novel)下观察其肢芽发育情况,并用HDCE-X3系列摄像头及ScopeImage 9.0软件测出肢芽实际横向生长长度和纵向生长长度,并且取其肢芽,于 1.5ml含有 1ml的 4%多聚甲醛溶液中固定保存,用于组织切片。
取材:取固定于 4%多聚甲醛 24h以上的肢芽,在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整,将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内。
脱水:将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水。75%酒精4h-85%酒精2h-90%酒精2h-95%酒精1h-无水乙醇I 30min-无水乙醇II 30min-醇苯5-10min-二甲苯I 5-10min-二甲苯II 5-10min-蜡I 1h-蜡 II 1h-蜡 III 1h。
包埋:将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框,待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于–20°冻台冷却,蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。
切片:将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片,片厚 4μm。切片漂浮于摊片机 40℃温水上将组织展平,用载玻片将组织捞起,并放进60℃烘箱内烤片。待水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。
石蜡切片脱蜡至水:依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95%酒精 5min-90%酒精 5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗。
苏木素染细胞核:切片入Harris苏木素染3-8min,自来水洗,1%的盐酸酒精分化数秒,自来水冲洗,0.6%氨水返蓝,流水冲洗。
伊红染细胞质:切片入伊红染液中染1—3min。
脱水封片:将切片依次放入 95%酒精 I 5min-95%酒精II 5min-无水乙醇Ⅰ5min -无水乙醇Ⅱ5min-二甲苯Ⅰ5min -二甲苯Ⅱ5min中脱水透明,将切片从二甲苯拿出来稍晾干,中性树胶封片。
将切片置于40×、400×的显微镜下观察、拍片。
利用SPSS20.0、Excel 2013、ScopeImage 9.0等处理软件,分析不同生长期的幼蟹再生能力和Ⅳ期幼蟹肢芽发育分期及分期的组织切片。
统计5期再生附肢肢芽比值,再生附肢肢芽比值=横向生长L1/纵向生长L2。
如表1所示,不同发育时期的幼蟹断肢后经过第一次蜕壳均可再生,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期幼蟹的第一次蜕壳后附肢再生率分别为59.9%,75.3%,74.2%,80.4%,69.5%,再生率随着发育时期呈现逐渐上升后下降的变化趋势,Ⅳ期最高;各发育期第一次蜕壳未生附肢率分别为14.1%,9.7%,9.9%,15.2%,4.9%,断肢组的存活率分别为89.4%,84.9%,85.2%,89.4%,74.2%。其中,第Ⅳ期的存活率(89.4%)和附肢再生率(80.4%)均
比其余各组高,且差异显著(P＜0.05)。三疣梭子蟹第Ⅰ期与第Ⅴ期断肢幼蟹存活率相同,均为89.4%,但第Ⅰ期附肢再生率显著低于第Ⅴ期附肢再生率(P＜0.05),而第Ⅰ期蟹未再生存活率(即第一次蜕皮未生附肢率)比第Ⅴ期幼蟹要高,说明第Ⅰ期幼蟹大螯即使不能再生,但是存活的能力仍然较强。通过对平均蜕壳周期数据分析发现,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期断肢组在去大螯后到完成第1次蜕壳所需的平均天数分别为3.33d,4.47d和6.27d,显著高于正常组的2.13d,3.89d和5.63d (P＜0.05),而Ⅳ、Ⅴ期完成第1次蜕壳所需的平均天数(7.12d、10.86d)极显著的高于正常组(6.11d、8.09d)(P＜0.01),且随着发育期的增加断肢再生的时间也随之延长。
如图2所示,在解剖镜下观察肢芽外部形态变化,三疣梭子蟹Ⅳ期幼蟹从大螯断肢到再生附肢大致经历6个发育时期,分别是:A-再生芽基、 B-肢芽趾缝期、C-肢芽分化期、D-肢芽斑点期、E-肢芽成熟期、F-肢体出膜期。三疣梭子蟹的幼蟹大螯被截断后,伤口逐渐愈合封闭,并在其下形成一个再生芽即再生芽基期,此时再生肢芽透明没有明显的外部特征;随着细胞的不断分化,B期会出现一条明显的趾缝,这个趾缝即为图2-F再生大螯附肢的长节(图2-F-f)和掌节(图2-F-d)分节线;再生肢芽不断的发育,C期外部形态分化显著,出现腕节(图2-C-c)及大螯可动趾(图2-C-e)的分化,肢芽仍然是透明的,这时肢芽的细胞分化已经结束;在C期的基础上,各分化细胞在原有的细胞构架上继续增殖,最明显的特征为D期出现素沉淀(图2-D-g),素不
断聚集增多,变暗直至深黑,再生肢芽为成熟E期;经过蜕皮伸展出再生附肢 F期,再生肢体的外部形态接近正常肢体水平,但能观察到显著的大小差异。
通过对外部发育及其对应切片进行分析,如图2-A所示在大螯附肢被截断瞬间,创伤的修复从伤口边缘表皮扩展并且覆盖切口表面,伤口愈合表皮增殖,产生一个多层的细胞团形成去分化的细胞,在断肢24h内,形成再生的肢芽。如切片图3-A2-a箭头所指,在新生的芽基中出现大片的组织溶解,细胞形成松散的间质,出现结缔组织,结缔组织细胞呈现类似胚胎期间质细胞形态,有去分化的功能。随着肢芽迅速分裂增生形成B期,对应组织切片图3-B2显示结缔组织逐渐被分化的细胞所代替,出现颗粒性的类似血细胞的嗜酸性细胞,为其他细胞提供营养,随后再生附肢细胞组织(图3-C2)发生分化现象,在切片显示上皮细胞和成纤维细胞排列整齐,按照已经分化好的细胞团的位置形成分化支架,再生肢芽不断依靠支架(图3-F2)进行成熟发育。总体上说,三疣梭子蟹大螯再生附肢所经历的6个发育时期,按照发育顺序进行组织切片发现,A期有大量未分化的结缔组织(图3-A2-a);结缔组织逐渐出现分化的细胞团,可以分辨出有营养功能的嗜酸性颗粒细胞(图3-B2-b);紧接着的C期中,细胞团逐渐增殖分化,肢芽明显分出三层:一层是中性粒细胞脱颗粒、第二层是松散组合的细胞和第三表皮细胞;最终松散组合的细胞充满肢芽,表皮细胞也从最初的不规则,经过不断增殖迁移形成规则的上皮细胞;到D期初
现肌纤维细胞,此时肢芽骨架已经形成(图3-F2),称之为上皮-间质系统,再生肢芽不断依靠支架进行组织分化,最终完善附肢的各个组织系统。