逄键涛 文思远 王升启3
(军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京100850)
摘 要 金纳米颗粒(G NP )探针正引起科学家们越来越多的兴趣。本文主要综述了基于G NP 自组装聚集反应的生物检测和微阵列2金标银染检测的最新进展，对G NP 在电化学等其他领域的研究前沿也进行了探讨。引用文献41篇。
关键词 金纳米颗粒，微阵列，生物检测，评述
2005208210收稿;2005212203接受
本文系国家863资助项目(No .2004BA519A46)
1 引 言
金纳米颗粒(G NP )是直径为0.8～250n m [1]的缔合胶体，具有纳米表面效应、量子效应、宏观量子
隧道效应。按粒子尺寸和聚集情况,G NP 可显示不同的颜，已被广泛用于光学、电学、电子显微镜
检
测的生物分子标记[2]。单个纳米颗粒的尺寸和颗粒间的组装形式，使胶体Au 溶液表现出不同的整体
特征。生物分子可参与到G NP 的聚集和组装过程中，从而干扰G NP 的原始组装方式。通过胶体Au 溶液最终的物理状态(如颜、吸光度等)可得到参与组装的生物分子的“质、量”特征，达到检测的目的。另外,G NP 逐渐在生物芯片检测中显现出应用前景。生物芯片技术本身是纳米尺度的分子操作和组装技术，芯片诊断、纳米检测等技术可以在此得到良好的融合。本文着重就G NP 自组装以及G NP 探针2微阵列技术进展作一综述。
2 生物分子辅助的GNP 聚集和组装
2.1 D NA 2GNP 探针
灵敏度高、特异性强、快速简单、低成本是生物检测的重要指标。基于G NP 聚集反应的分子诊断方法能满足这些要求。M irkin 发现DNA 特异杂交可使DNA 2Au 颗粒自组装为复合结构，开创了G NP 用
于生物检测的新领域[3]。G NP 经巯基修饰的短链DNA 修饰成为编码探针[4]，溶液中加入目标互补
DNA 后，纳米颗粒发生有序、可逆的聚集反应[5]。聚集后溶液颜发生红→桃红→紫变化，几小时
出现桃灰沉淀(DNA 2胶体金沉淀)。该现象是DNA 介导的胶体2胶体键合，其过程是可逆的。系统在没有优化的情况下能检测10f mol 的寡核苷酸。
DNA 修饰的G NP 以非交联结构聚集，对于颗粒表面结合的杂交体末端错配有很好的选择性[6]，可
对单核苷酸多态性(S NP )进行检测。5个人瘤细胞系的基因组DNA 的检测结果与传统方法(质谱、直接测序)一致。这种方法不需要复杂的设备，为S NP 医护现场诊断、个性化医疗提供了可能。St orhoff 等[7]研究了G NP 距离和光学性质的关系，开发出“杂交2读出”的比检测方法，鉴别核酸序列。DNA
修饰的金纳米探针识别核酸目标分子后发生颜变化，可检测到z mol (10-21mol )级的核酸，不需要目
标分子的扩增或信号放大。S nnichsen 等[8]采用等离子体耦合对金银纳米颗粒间距进行测量，研究了金银纳米颗粒二聚体的实时组装以及单个DNA 分子杂交的动力学。“等离子体标尺”可连续监控分子间距离上限达到70n m ，时间超过50m in 。
2.2 非标记D NA 检测
双链DNA (ds DNA )比单链DNA (ss DNA )表面负电荷堆积程度高，并且ds DNA 的双螺旋结构使氮(N )、硫(S )等对G NP 亲和性高的原子包埋更深，所以ss DNA 和ds DNA 对G NP 有不同吸附力。L i 等[
9,10]据此设计了基于Au 颗粒聚集反应的核酸杂交比检测方法。ss DNA 可吸附负电荷纳米金颗第34卷2006年6月 分析化学(FE NX I HUAXUE ) 评述与进展Chinese Journal of Analytical Che m istry
第6期884～888
粒，其结合速率与序列长度和温度有关。G NP 吸附ss DNA 之后处于稳定状态，不会发生盐离子引起的聚集反应。纳米颗粒对核酸的吸附为静电作用，不需要对Au 颗粒、探针或靶序列进行共价修饰。目标分子和探针的结合是在溶液中进行的，其杂交时间少于1m in，整个检测只需5m in，不需借助仪器可检
测到小于100f mol (10-15mol )靶分子。
2.3 蛋白质检测
标准凝胶免疫测定(SP I A )是基于G NP 的生物特异性聚合和分光光度技术，用于蛋白质的检测。
Dykman [11]报道了一种新型的SP I A 技术方法：采用微量滴定免疫板和酶联免疫吸附测定(EL I S A )阅读器。以15n m Au 颗粒偶联的蛋白A ，检测I gG，研究比较了新型SP I A 和普通SP I A 。该方法的原理是生物分子2纳米金溶液的消光光谱在目标分子加入前后的变化，可能与Au 颗粒的聚合作用有关。
3 GNP 标记与微阵列检测
随着高并行化、微型化检测需求的增长，荧光DNA 芯片在DNA 诊断学方面受到的关注越来越多。荧光检测已被证明为有效可用并得到很好的开发，但它有一些问题难以解决，比如染料的低稳定性、物理化学环境影响到其发光强度、昂贵的检测设备等。基于G NP 标记和银增强技术的微阵列检测技术，方法简单，成本低，信号灵敏、稳定，不受外部环境的影响，有利于微阵列技术在中小型医院的推广和医
护现场检测[12]。
3.1 GNP 标记微阵列检测原理
G NP 与生物活性分子的交联可得到大量新型的标记探针，如:Au 2脂质、Au 2N i 2NT A 以及Au 2ATP 等[13]
。G NP 在固体表面的组装定位和金标银增强技术是纳米颗粒2微阵列检测的理论基础。
Cs áki 等[14]采用扫描原子力显微镜研究了纳米金颗粒标记DNA 分子在芯片表面的分布和标记情
况。Peschel [15]研究了G NP 的自组装过程及结构性质，尺寸及结构依赖物理性质。DNA 具有独特的识
别能力和物理化学稳定性，可作为G NP 的连接分子。DNA 修饰的Au 胶体颗粒(1～40nm )特异性固定在互补DNA 修饰的固体表面，构建出表面nm 结构。
Au 2Ag 染法是一种灵敏特异的可视化检测技术，源自现代照相技术、组织化学和免疫金技术，经过近10年来的优化组合，现已得到广泛应用[16]。Ag 在Au 标记位点特异性沉淀，是一种光学或电子显
微镜下的低放大率可视化方法。Festag 等[17]对G NP 2微阵列检测技术条件进行了优化，研究了不同的
生活中最常见纳米技术基底清洁、活化以及封闭方法，并优化了纳米颗粒标记及其他程序。
3.2 XNA(D NA 、RNA)及SNP 检测
Tat on 等[18]最先开发出G NP 用于DNA 阵列分析的简单方法，包括寡核苷酸修饰G NP 探针和平板
扫描仪。G NP 标记的寡核苷酸目标分子在固体表面的熔解温度发生改变。寡核苷酸互补序列与单核苷酸错配序列熔解温度的差异，可用于二者的鉴别，选择性是荧光标记方法的3倍。Ag 增强信号放大
方法可提高扫描度阵列检测系统的灵敏度，超出荧光系统2个数量级。A lexandre 等[19]提出了一种
新型的比检测方法，使微阵列技术可能成为用于科研和临床中的高效、低成本检测工具。G NP 通过
亲和素结合在生物素化的DNA 上，其结果信号产生于Ag +在G NP 表面的还原沉淀。该比方法与荧
光检测方法相比较，检出限相当，大约为1a mol (10-18mol )生物素化的目标DNA 。W ei 等[20]采用寡核
苷酸和拉曼活性染料标记的G NP 探针实现了寡核苷酸的多重检测。Ag 沉淀形成的Au 2Ag 核壳结构可引发染料标记颗粒的表面增强拉曼散射。方法在未优化条件下的检出限为20f mol，具有高灵敏度和高特异性的特点。采用拉曼标签作为窄带光谱指纹，据此可随意设计所需探针，增加了方法的多重和多比
率检测能力。Bao 等[21]提出了一个微阵列检测方法，可进行多重S NP 分型，不需目标扩增和去复杂性。
该方法依赖于G NP 探针的高灵敏度，不需要酶的参与。特异性源于寡核苷酸和纳米探针的两步夹心杂交。用非扩增人基因组DNA 样品检测3个血栓症基因的可能基因型，表明这种多重S NP 检测方法重现性良好。该阵列检测方法简单、快速、稳健，适于多重S NP 的医护现场检测。
3.3 微生物诊断
微阵列已逐步成为细菌检测和鉴定的新方法，具有高并行性检测的特征，但检测方法的复杂性和灵588第6期逄键涛等：金纳米颗粒聚集以及金纳米探针2微阵列技术研究进展
688 分析化学第34卷
敏度问题成为技术瓶颈。Francoisa等[22]报道了一种新的检测技术，直接标记细菌总RNA，避免了酶放大的多步反应和可能的偏向性(如PCR)。该研究比较了白光光源性能和2种激光荧光扫描仪检测的可靠性和灵敏度。结果显示：纳米颗粒标记的细菌RNA能产生可重复性的共振光散射信号，强度至少是当前最新的共聚焦荧光信号的50倍。
W ang等[23]开发了一种基于纳米颗粒放大和夹心检测技术的乙肝病毒基因检测芯片,HBV特异性探针固定于玻片表面，与不同血清样本的PCR(聚合酶链式反应)产物杂交，杂交信号能容易地可视化观察。庞代文等[24]采用纳米颗粒基因探针的可视化基因检测技术，采用“纳米放大”和银染方法，对目标分子夹心杂交进行检测。Ra makrishnan等[25]采用金纳米探针结合微阵列技术检测甲氧西林耐药性金黄葡萄球菌。以上方法避免了放射性、荧光或目标分子的扩增(PCR)，具有简单、快速、灵敏度高、低成本的特点。
3.4 表达谱研究
基于微阵列方法的基因表达分析在现代生物学中起了关键作用，但目前的微阵列基因表达谱大都需要反转录将mRNA转变为标记c DNA或cRNA。在cRNA反转录过程中包括目标放大步骤，克服了普通荧光方法低灵敏度的缺点。Huber等[26]报道了一种基于微阵列无酶扩增的基因表达分析系统，采用非扩增的人总RNA样品作为目标核酸。杂交固定在微阵列表面的RNA分子通过其poly2A尾与oligo2 dT20修饰的G NP探针杂交，信号由自动金相放大，然后由纳米颗粒介导的光散射检测。纳米颗粒探针灵敏度高，可用少至0.5μg非扩增总RNA杂交进行基因差异表达分析，而不需费时、费力的样品标记。
m i RNA的表达谱研究对于m i RNA的生物功能研究有重要意义。为避免使用高成本的检测仪器, L iang等[27]在实验中采用了纳米金颗粒探针及Ag增强方法，开发了一种新型的m i RNA表达谱微阵列。作者制作了检测11种来自水稻根、叶的m i RNA的微阵列模型，有很好的实验重现性并与Northern bl ot 结果一致。St orhoff等[28]用巯基修饰寡核苷酸的G NP探针，检测互补的目标DNA。玻片表面固定有寡核苷酸捕获探针，用于捕获目标DNA，之后目标DNA通过G NP探针检测。Ag放大后的信号通过简单的光学系统检测散失波诱导光散射。与Cy3荧光标记相比，该方法的信号增强了1000倍。可直接检测微生物的非扩增基因组DNA，并可检测鉴别人基因组S NP。
最近,DNA微阵列方法被开发用于检测多个基因的甲基化状况。J i等[29]开发了一种linker2PCR检测4种基因的甲基化状况的微阵列。G NP是通过亲和素结合在生物素化的DNA上的,Ag+在纳米金颗粒表面还原沉淀，可检测0.1f mol的目标DNA。实验结果与甲基化特异的PCR(MSP)和双硫DNA测序结果一致。
因此它可作为一种价格低廉、有用的灵敏检测工具，用于多基因甲基化检测。
3.5 蛋白质检测
蛋白微阵列杂交可以用许多种方法来检测，实用性差，难于推广，原因是这些方法都需要大型、昂贵的仪器设备。Han等[30]开发出一种基于G NP标记抗体的简单、便宜的检测方法，信号可通过商品化的办公用桌面平板扫描仪可视化获得。扫描电子显微镜研究显示：平板扫描仪得到的信号与抗体2金结合的表面密度有关，平板扫描仪可检测6a mol的抗体2金颗粒偶联物。该检测系统用于竞争免疫检测水样中农药残留代谢物BAM浓度，结果证明金标抗体检测方法与荧光免疫测定法的性能相当。Guo等[31]在实验中综合了“一步”双单克隆抗体夹心法、低密度蛋白阵列、Au标记Ag增强技术，对心肌钙蛋白I (cTn I)进行纳米金探针免疫测定。检测过程包括免疫反应和Ag放大两步反应。结果用平板扫描仪或肉眼观测。整个过程在40m in内完成，而常规E L I S A方法需要3h，两种方法的灵敏度大体相同。
G NP标记的高灵敏度、磁珠富集分离技术，两者结合可以极大提高检出限。Mandal[32]成功地在80℃胶乳水介质中合成了Fe4O3纳米颗粒(约13nm)，并在其表面镀了金薄层，厚度通过调整反应液成分控制。Na m等[33,34]开发了一种超灵敏的检测蛋白样品的方法。该系统包括：磁微粒表面修饰第一抗体,G NP表面修饰了条码DNA和第二抗体；有目标蛋白存在时，磁微粒、金纳米探针、目标蛋白形成夹心结构。复合物经磁场分离，富集的金纳米探针热变性，释放条码DNA，对其进行无PCR或PCR检
测，间接检测目标蛋白，检出限分别达到30a mol和3a mol。作为一个例子，他们采用生物条形码方法在30个人脑脊液中检测了阿尔兹海默病(AD)病原标志物(ADDL)，而ADDL或其它AD标记物由于在体
内含量很低，传统方法不能检测(<1pmol/L )。本课题组采用Au 标记Ag 增强技术结合微阵列技术，检测了艾滋病病毒的4种抗体[35]，并开发了几种便携式读出装置和软件系统。
4 总结与展望
微阵列诊断的应用领域将不断拓展，特别是在一些瓶颈问题(如重现性和标准化)得到解决之后。而这些问题主要与现有的荧光标记方法有关，所以任何标记方法的改进都将有益于芯片诊断技术的推广。如果这些问题得到解决，芯片诊断技术将得到推广并实现更高的并行性检测，其结果是开发出适合于个人使用、成本更低的检测仪器，并能够从中获得更多的诊断信息。G NP 具有高稳定性，可以作为光学芯片技术开发中的优选方法。它作为稳健的信号系统在前期的基础研究中已得到证明，可能成为仅次于或相当于荧光标记的标记技术。荧光标记技术已被广泛地长期应用，也比纳米颗粒有自身优势，如多标记和小分子尺寸。因此，荧光和G NP 将会并行采用。
除光学检测之外,G NP 增强的电化学方法也显示了美好的前景[36]。比如,G NP 修饰的寡核苷酸与
捕获探针结合后导致导电率变化，据此开发出一种DNA 微阵列检测方法[37]
。
在电极的夹缝内固定捕获探针，目标分子结合后,G NP 处于电极间的缝隙内,Ag 在G NP 的还原沉淀造成导电率的变化。通过前后的电阻测定，可检测其杂交信号。这种方法DNA 的检出限可达500f mol 。现在的光学检测装置可
能会被低成本、易集成的微型接触式仪器所替代。另外，表面等离子共振(SPR )[38]、石英晶体微天平
(QC M )[39]、拉曼共振波[40]以及G NP 淬灭荧光检测[41]等方法也有报道。
不同尺寸和形状的G NP 可能表现出许多新奇的纳米特征。另外,G NP 与生物大分子在不同条件下的相互作用将成为以后的研究趋势。这两个研究领域的进展将产生G NP 在生物医疗、生物诊断方面的应用潜力。G NP 以其独特的性质，在纳米科学、微型化分析技术等方面有着越来越多的应用。它的生物相容性好、标记及检测方法简单，适于开发医学救护现场检测设备。随着对其物理化学性质和纳米介观效应的深入研究,G NP 在生物分子检测领域将具有美好的前景。
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D evelop m en t of the Aggrega ti on of Gold Nanoparti cles
and Nanoprobe2M i croarrays Technolog i es
Pang J iantao,W en Siyuan,W ang Shengqi3
(Institute of Radiation M edicine,A cade m y of M ilitary M edical Sciences,B eijing100850)
Abstract Gold nanoparticle(G NP)p r obes have ar oused more and more interest recently.Here we revie w the app licati on and advance ment of G NP p r obes in bi oassay,which focuses on the aggregati on of G NP and m icr oarray detecti on.The concerned electr oche m ical and other methods have als o been discussed.41papers ware cited.
Keywords Gold nanoparticle,m icr oarray,bi oassay,review
(Received10August2005;accep ted3December2005)
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