原创详细解读CART细胞通⽤⽣产规程
嵌合性抗原受体修饰的T细胞(CART)免疫在多种⾎液病和实体瘤中研究，对B细胞恶性肿瘤具有显著疗效。从病⼈外周⾎中提取T细胞，进⾏加⼯，使其表达嵌合性抗原受体，再现对肿瘤细胞的杀伤作⽤。随着后期临床试验的到
来，CART细胞疗法为更多病⼈的提供了选择⽅向，伴随⽽来的，CART细胞的通⽤⽣产要求则成为⼴泛性讨论的话题。并且，从单个研究机构到⼤规模多点⽣产中⼼制造CART的挑战必须得以解决。在CA19嵌合性抗原T细胞疗法----CTL019这个基础上，已经预料到这样的问题。在本⽂中，我们将讨论细胞⽣产过程涉及的技术步骤，包括细胞⽣产中最佳的使⽤载量，以及解决嵌合抗原受体T细胞全球病⼈⾯临的挑战。（⽂末有精彩在线分享）
CAR T细胞是⼀种使病⼈T细胞重新带有特异性靶抗原和杀死肿瘤细胞能⼒的细胞疗法。CARs 在基因⽔平上涉及融合蛋⽩，包括（1）来⾃单克隆抗体的抗原识别区域；（2）胞内区T细胞信号和共刺激分⼦。CART作为癌症的，已经⼴泛地应⽤在B细胞恶性肿瘤病⼈中，早期的结果令⼈⿎舞。例如，在I期临床，CART细胞疗法在⼉科病⼈、复发或难治性急性淋巴细胞⽩⾎病中表现出69% - 90%的完全缓解率。CART细胞的进展现已扩展到第1阶段试验，并进⼊第2阶段多点试验，科研单位和企业主要的考虑的是如何使CART细胞⽣产规模化。这⾥，我们描述了CART细胞⽣产的过程，并且讨论监管问题，必须解决如何成功地⽣产⼤量患者所需求的CART细胞。
CAR T细胞的⽣产
CART细胞的⽣产需要⼏个详细的步骤，质量控制检测贯穿于整个过程。⾸先，该⽅法从患者体内的外周⾎中分离⽩细胞，并将其他成分返回⾎液循环。当⽩细胞收集⾜够后，⽤⽩细胞分离产品对T细胞进⾏富集（图1）。淋巴细胞的富集可以通过密度梯度离⼼法完成，此法根据细胞的⼤⼩和密度分离，并保持细胞活⼒。T细胞亚的分离通过CD4/CD8特异性抗体或者表⾯标记偶联磁珠进⾏分离。更加⾼效地激活T细胞，可利⽤CD3/CD28单克隆抗体磁珠或者⼈⼯刺激的APCs（aAPCs），这些⽅法的使⽤⽐以前的单独抗CD3 抗体或联合IL-2效果更好。在选择刺激源时同时也可以考虑将T细胞在扩增中极化为特异性表型（例如Th2或Th17）。T细胞激活后，转染编码CAR的病毒载体。病毒载体利⽤病毒机制连接⾄病⼈细胞，进⼊细胞内后，载体已RNA的形式将基因转导。在CAR T细胞细胞中，此基因编码CAR。RNA 反转录成DNA，并永久地整合到病⼈细胞的基因组；因此，CAR可以在细胞分裂是得以表达，并且在⽣物反应器中也可以扩增。CAR通过病⼈细胞进⾏转录和翻译，且表达于细胞表⾯。⽬前，基因整合⽅式包括有慢病毒、γ逆转录病毒、睡美⼈转座⼦系统或mRNA转染、mRNA电转，相对⽽⾔，慢病毒有不可替代的优势。⽣物反应器培养系统的设计，提供最佳的⽓体交换的要求和细胞扩增所需，满⾜临床的使⽤（图2）。⽬前⽤于CART细胞培养的⽣物反应器或系统主要有Wave 反应器、G-Rex及CliniMACS Prodigy。综合实际情况考虑，CliniMACS Prodigy可以完成细胞的制备，富集，刺激，转导，扩增，最终收集和采样，是最适合⽤于临床试验中T细胞的制备。当细胞
扩增完成，细胞培养体积⾄5L，必须将细胞浓缩⾄⼀定体积回输给病⼈。将清洗和浓缩的细胞冻存起来，接着经过产品放⾏，冻存细胞运输⾄⽬的地再解冻回输给病⼈。
图1、2细胞培养和转导
CAR T细胞运⽤与全球病⼈的挑战
虽然临床级别的CAR T细胞⽣产的操作规程已经建⽴，但是⽤于的CAR T疗法只限于很少的⼀部分病⼈。如果要应⽤于更多临床实验、更多病⼈，这个⽣产规程则应该更好地进⾏评估，以保证产品
的有效性。因为CAR T细胞仅能⽤于靶向的癌症，所以载体及CAR T细胞的⽣产规模也依赖于指征的影响。其他原因还有，修饰细胞的载体，基因的长期安全性以及合适的全球监管措施。常远
细胞处理的⼀致性：最佳载体的使⽤
在美国和欧盟，转染CAR的病毒载体是CAR T细胞⽣产过程的关键性原料，修饰后T细胞被认为是临床实验的最终产品。编码CAR的病毒载体可以⼤规模⽣成，低温条件下可长期保存。由于终产品CAR T细胞⽆法通过过滤来达到⽆菌，故载体的⽣产必须在GMP条件下进⾏，⽆菌相当重要。以保证最终载体产品和细胞的⽆菌。批量制造细胞疗法的病毒载体⾄少需要2周，⾸先培养⾜够数量的细胞，如HEK293T细胞，⽤于质粒转染，转染质粒通常是（1）GAG /聚合酶包装结构；（2）异种来源编码的包膜糖蛋⽩；（3）表达病毒辅助蛋⽩的结构Rev；（4）编码CAR的载体质粒构造以及⾼效反转录、RNA包装与整合所需的其他序列。载体系统应该采⽤⼀些关键的安全特性，全⾯防⽌复制能⼒的再⽣的可能（例如：密码⼦优化的GAG /聚合酶，最⼤限度地减少载体成分之间的同源性，防⽌病毒重组，长末端重复序列⾃我失活，并除去所有不必要的序列和辅助基因）。病毒收集后，经过过滤、纯化、去除杂质等，质量合格后，在⽆菌条件下进⾏除菌过滤以及分装，最后冷冻保存。
建⽴针对载体安全性、⽆菌、纯度、效能、特性以及浓度测定的质量控制试验是⾮常重要。美国⾷品药品监督局编写的指导⽂件对此质量控制试验进⾏了具体描述。其中包括临床前试验或者动物毒理试
验、⽆菌试验检、复制性慢病毒检测、⽀原体检测，杂质检测包括核酸酶、BSA、宿主细胞DNA以及质粒DNA。
在CTL019细胞的形成中，单⼀的载体来源是⽐较合适的，载体供应商应满⾜GMP标准以及能够满⾜⼤量⽣产需求等条件。此外，监测保存期间载体滴度是否稳定的稳定性试验是保存期决定性的试验。载体的质量的保证，可以减少⼯艺验证的风险。为提⾼转染效能需在T细胞激活，慢病毒需要在细胞激活期间进⾏转染。载体DNA整合⾄宿主细胞，致癌基因附近导致的插⼊突变是⼀个与所有载体有关的潜在问题。慢病毒整合位点常远离启动⼦，⽽逆转录载体整合的位点常
位于转录起始位点，说明慢病毒载体有较低变异的可能。⽬前的研究表明，载体的设计出现RCRs/RCL致瘤的可能性很低。安全⾓度出发，CART细胞必须检测RCRs/RCL。
图3 慢病毒制备⼯艺流程
调查载体的长期安全性以及患者随访
评价细胞及基因的病毒载体的安全性需要进⾏长期的随访。前⾯已经提到卫⽣部门要求病毒载体的长期随访，然⽽具体要求在各国也不尽相同。例如，美国要求接受CD19CART细胞的的患者需要接受15年随访
（NCT02445222），包括任何年龄的患者以及任何类型B细胞恶性肿瘤。随访的⾸要⽬的是发现疑似CD19CART细胞相关延迟性的副反应，如新发恶性肿瘤、神经系统或⾃⾝免疫系统疾病的新发或进展。随访的其次⽬的是监测CTL019在外周⾎持续存在时间以及长期的效果。CTL019细胞可以通过qPCR检测其转基因。第三各⽬的是监测患者肿瘤的复发或者进展，以及任何原因导致的患者死亡。由于CART的持续存在对妊娠的作⽤尚不清楚，因此接受CART细胞⼥性的⽣殖系统健康以及妊娠的结果也是随访的监测内容。总之，对CART细胞的病毒载体的严谨设计和⽣产使其安全性能最⼤化、质量及安全检测以及患者长期随访，确保患者安全乃当务之急。
确保产品从单⼀机构⾄多个⼤规模⽣产过程中的质量保证
CART细胞产品的扩展最⼤的挑战是如何从科研机构⾛向质量⾼度可控的⽣产中⼼。因此，从标本采
集到的之间的合理安排⾄关重要。CTL019的质控指标包括细胞数量、转染效率、细胞⽣长率、细胞表型以及功能分析。⽣产中建⽴关键的质控点，有利于建⽴连贯的⽣产和质控过程，保证产品的均⼀性。然⽽，每个产品的CAR阳性率、活⼒、表型和杀伤均不相同。供应商协议，是维持可控性⽣产的关键。在CART细胞中，产品的均⼀性也是挑战，病⼈单采原料之间的差异较⼤。因此，我们必须控制CTL019和载体的⽣产过程，这样才能减少制造过程中产⽣的差异。
满⾜全球性监管预期的CART细胞的成功做法
CAR T细胞疗法使病⼈获益，从⽽提供不同监管机构国际合作的机会。合规是其发展的关键因素，也是全球化的挑战。FDA多年来⼀直致⼒于监管细胞和基因，并发布了相关的指导性⽂件。⼀些其他主要国家在审查临床试验时的侧重点不同。参与临床实验的国家越多，就越需要⼀个切合所有问题和法规要求的稳健⽣产过程。为了协调细胞和基因疗法的新兴领域，在2012年10⽉11⽇，全球监管机构召集成⽴⼀个综合⼩组，讨论细胞/基因疗法的最佳实践。CAR T细胞开发者应对多样化的监管格局有透彻的了解。在建⽴统⼀的法规及各地区有着共同经验之前，各个地区的⽣产存在不同的需求。例如，每个国家在供体的筛选和检验，可追溯性和标识、病⼈的保密性和单采要求上存在很⼤不同；另外，各区域对材料的质量控制的要求各不同。平衡不同国家的要求与起始材料的质量要求具有挑战性，但⾄关重要。因此，解决监管问题，规范CAR T细胞⽣产材料的使⽤，以符合全球主要地区的质量要求（例如，在全球地区使⽤相同的国际供应商）。
CART细胞的发展和产业化⽅⾯的其他活跃的研究领域
CART细胞的副作⽤有细胞因⼦释放综合征（CRS），尽管⼤部分CRS病例是可以控制的，但利⽤有效机制使CART细胞失活，有助于提⾼其的安全性。在CAR基因中插⼊诱导细胞凋亡的开关基因是正在研究的策略，有助于机体可控地清除CART细胞；另⼀个提⾼CART安全的⽅法是提⾼特异性，尤其是实体性肿瘤中。再有，⾮同源性“货架型”CART 细胞也是⼀个新的研究策略，利⽤基因剪辑技术破坏内源性TCRα基因，从⽽减轻⾮同源性引起的GVHD。减少衰竭T 细胞有利于提⾼CART细胞的效⼒。因此，选择CAR信号⽚段、细胞亚型、调整培养条件来降低T细胞衰竭，对获取⾼质量CART细胞产品具有重要的作⽤。
结论
CART细胞在美国B淋巴瘤病⼈取得的成功，预计会有⼤量病⼈接受CART细胞。然⽽，试图将复杂的细胞⽣产过程放⼤⾄适合全球范围，有许多⽣产和监管的挑战需要考虑。如果将⽬前CTL019的CD19 CART细胞⽣产的应⽤⾄全球范围，则需简化⽣产过程。我们应与学术机构、供应商建⽴强⼤的协作来深⼊调查的产品和⽣产过程，确保材料受控，保证产品质量。在预期的监管和产品化前，积极地解决这些问题，有利于加快产业化的进程，从⽽为更多病⼈提供有保障的途径。
参考⽂献
Levine BL, Miskin J, Wonnacott K, Keir C.Global Manufacturing of CAR T Cell Therapy.Mol Ther Methods Clin Dev. 2016 Dec 31;4:92-101.
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