李金秀，刘照雷
沂水县动物疫病预防控制中心，山东沂水 276400
摘 要：[目的]对山东省临沂市部分地区的奶山羊场进行了患病山羊粪便和组织的大肠杆菌分离鉴定并分析其耐药性。[方法]采集患病奶山羊粪便、血液、肝脏、脾脏组织，胸腹腔及心包腔内浆液性纤维性渗出物等病料68 份，送至实验室诊断。经过预处理后，利用分离培养基和生化鉴定方法成功分离出大肠杆菌。[结果]在药敏试验中，发现大肠杆菌对青霉素、链霉素、阿奇霉素、克林霉素、庆大霉素、左氧氟沙星和麦迪霉素等药物表现出较高的耐药性，而对头孢唑林、头孢拉定、头孢他啶和头孢哌酮等药物具有较强的敏感性。细菌多重耐药性分析显示，耐药率超过60%的抗生素药物共有9 种。[结论]山东省临沂市部分地区的奶山羊场中存在大肠杆菌的耐药性问题，为了保障当地奶山羊养殖业的发展和山羊乳制品的质量安全，需要采取相应的预防和控制措施。
关键词：山羊；大肠杆菌；分离鉴定；耐药性分析
文章编号：1671-4393（2023）08-0069-06 DOI:10.12377/1671-4393.23.08.12
0 引言
大肠杆菌作为山羊舍中常见的致病菌，可能对山羊健康和舍环境安全构成威胁。分离鉴定和耐药性分析是研究细菌的方法，目的是确定细菌种类和药物敏感性，为疾病的诊断和提供科学依据。其中，耐药性分析可以确定细菌对不同抗生素的敏感性，为药物提供指导，避免药物滥用和抗药性的增加，还可以监测细菌的耐药性变化和流行趋势，为制定抗菌药物使用策略和预防耐药菌株的产生提供重要依据。
沂水县位于临沂市，地理坐标为东经118.34°~118.54°，北纬35.46°~35.70°，县城海拔约80 m。该地区气候和地形条件适宜奶山羊的生长和繁殖。近期，笔者所在沂水畜牧兽医防疫站（简称“防疫站”）发现某奶山羊场大约30 只山羊发生了疾病，其他养殖户也出现了类似的情况。奶山羊出现食欲下降，体温升高，呼吸急，腹泻、拉稀、便血等症状，导致产奶量下降和生产性能降低。根据临床症状，笔者所在防疫站高度怀疑是大肠杆菌引发的疾病，因此，对发病奶山羊进一步进行了细菌学的分离鉴定和耐药性分析，为该地区有效诊治奶山羊疾病提供参考。
作者简介：李金秀（1975-），女，山东临沂人，本科，高级兽医师，研究方向为畜牧兽医。 刘照雷（1984-），女，山东临沂人，本科，高级兽医师，研究方向为畜牧兽医；
Disease Prevention
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 样本来源
2021年8月初，针对山东省临沂市沂水县某奶山羊场开展调查，分别采集患病奶山羊粪便、血液、肝脏、脾脏组织，胸腹腔及心包腔内浆液性纤维性渗出物等病料68 份，送至实验室诊断。
1.1.2 样品处理方法
组织样品处理方法：（1）粪便样品：取适量粪便样品，加入适量无菌PBS缓冲液，混匀后离心，将上清液保存用于后续分离鉴定试验。（2）血液样品：取适量血液样品，加入抗凝剂，离心分离血清。将血清与相等体积的无菌PBS缓冲液混合，得到1︰1的血清稀释液，作为后续分离鉴定试验样品。（3）肝脏、脾脏等组织样品：取适量组织样品，用无菌PBS缓冲液清洗，然后用无菌剪刀和手术刀将组织切碎，加入适量无菌PBS缓冲液，经过均匀混合后离心，将上清液保存用于后续试验。
胸腹腔及心包腔内浆液性纤维性渗出物处理方法：（1）悬液制备：取适量样品，加入无菌蒸馏水或生理盐水中，制备成均匀的悬液。（2）分离培养基的选择：根据不同的细菌生长特性，选择适宜的分离培养基。（3）涂布和孵育：将悬液平铺于分离培养基上，通过涂布或滴布等方法使其均匀分布，然后在适宜温度下孵育。（4）鉴定：通过菌体的生长形态、生化反应等特征，对菌落鉴定确认。同时也可进行分子生物学检测，如PCR、16S rRNA基因测序等。
1.1.3 分离培养基
（1）麦康凯琼脂培养基
主要成分包括蛋白胨、葡萄糖、胆盐、中性红等，用于选择性分离革兰氏阴性菌，如大肠杆菌等。pH值为7.1～7.5，处理条件为37 ℃、24～48 h，115 ℃灭菌20 min。
（2）伊红美蓝琼脂培养基
主要成分包括蛋白胨、葡萄糖、亚甲基蓝等，用于选择性分离大肠杆菌和其他肠道细菌。pH值为6.9～7.3，处理条件为35～37 ℃、18～24 h，121 ℃灭菌15～20 min。
（3）远藤氏琼脂培养基
主要成分包括肉汤、亚硝酸盐、碳酸氢钠、葡萄糖、胆盐等，用于选择性分离大肠杆菌和其他肠道细菌。pH值为7.2～7.6，处理条件为35～37 ℃、18～24 h，121 ℃灭菌15～20 min。
（4）SS（Salmonella-Shigella）琼脂培养基
主要成分包括肉汤、胆盐、亚硫酸盐、甜菜红等，用于选择性分离沙门氏菌、志贺氏杆菌等革兰氏阴
性肠道杆菌。pH值为7.2～7.4，处理条件为35～37 ℃、18～24 h，121 ℃灭菌15～20 min。此外，不同实验室可能会略有差异，因此建议按照具体厂家说明书或实验室标准操作。同时，在灭菌过程中也需注意保持培养基pH值和温度等条件的稳定性，保证培养基质量。
1.2 试验方法
1.2.1 菌落鉴定
如果是大肠杆菌感染，被检测出的菌落为直径2～5 mm的圆形或不规则形状，边缘整齐，颜为乳白或灰白，表面较光滑，有时会有少量分泌物。在MacConkey（麦康凯）培养基上，菌落为粉红或紫红，而在EMB（伊红美蓝）培养基上为金属光泽的暗红或深紫，具有典型的金属光泽。此外，还有明显气味，有时会散发出刺鼻气味。
1.2.2 生化鉴定
（1）革兰染：使用革兰染法进行初步鉴定，大肠杆菌为革兰阴性菌。（2）气体产生试验：大肠杆菌可通过产生气体来代谢葡萄糖，因此可通过观察培养基上是否产生气泡初步鉴定。（3）琼脂凝胶电泳：使用琼脂凝胶电泳法对大肠杆菌的蛋白质进行分离，从而鉴定其生物化学性质和特征。（4）尿素酶试验：大肠杆菌通常具有尿素酶的活性，可通过观察其是否分解尿素鉴定。（5）氧化/
发酵试验：大肠杆菌可利用葡萄糖等碳水化合物进行氧化或发酵代谢，包括葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇等，可通过观察培养基上酸碱变化鉴定。（6）酸产生试验：大肠杆菌可通过代谢产生酸，可通过观察培养基上酸碱变化或使用酸碱指示剂鉴定。这些方法可结合使用，对山羊大肠杆菌进行准
确生化鉴定[1]。
1.2.3 药敏试验
药敏试验是用于检测大肠杆菌对不同抗生素敏感性的试验。具体操作步骤如下：（1）选取代表性菌落：从已纯化的大肠杆菌培养基中选取一些代表性菌落，通过荧光染、革兰染等方法鉴定其属于大肠杆菌。（2）制备菌液：取一个菌落接种于含有0.9%生理盐水的试管中，制备成浑浊菌液，用光度计测定其浓度，使其约为0.5 McFarland标准（相当于约1.5×108 CFU/mL）。（3）选取药敏试验板：从已制备好的药敏试验板中，选取适合的板进行检测。药敏试验板上含有不同抗生素，通过在板上形成不同浓度的抗生素梯度，检测菌株对各种抗生素的敏感性。本次检测了常见药物：β-内酰胺类抗生素、氟喹诺酮类抗生素、氨基糖苷类抗生素和大环内酯类抗生素[2]。（4）稀释菌液：取一定量菌液加到含有生理盐水的试管中，制备不同稀释度的菌液，最终得到约1.5×105 CFU/mL的菌液。（5）滴加菌液：取一定量菌液加到药敏试验板上，使其均匀分布于试验板表面。（6）孵育：将药敏试验板放置在适当温度下，一般为35 ℃，孵育时间16～24 h。（7）判读结果：观察试验板上菌落生长情况，
测定菌落直径，根据抑菌圈大小和抑菌程度，判断菌株对各种抗生素的敏感性。通过药敏试验可评估大肠杆菌对不同药物的敏感性和耐药性，为制定合理方案提供依据。药物敏感试验判定标准见表1[2，3]。
2 结果
2.1 临床症状
奶山羊患大肠杆菌病的初期临床症状包括食欲不振、发热、精神萎靡、体重下降、呼吸急促等，体温升高至40～42 ℃，有时也出现腹泻、腹痛、腹胀等症状。在严重病例中，奶山羊可能出现血性腹泻、呼吸困难、虚脱等危及生命的症状。患病后期病情加重，出现脱水、四肢僵硬，不及时在数天内死亡。
2.2 剖检症状
剖检症状主要包括：（1）肠道炎症：大肠杆菌会引起山羊肠道炎症，导致肠道肿胀、充血等症状。（2）脏器损害：大肠杆菌病严重时，可能会引起山羊脾脏、肝脏等器官损害，导致这些器官肿大、变形等症状。（3）渗出物：山羊患大肠杆菌病后，胸腹腔和心包腔内可能有浆液性或纤维性渗出物，这些渗出物可能对器官造成压迫和损害。（4）脓肿：在严重感染情况下，山羊可能在不同部位形成脓肿，需及时处理。
2.3 病原菌分离
病原菌分离一般采用无菌技术，从68 份样品中分离具有共性病原菌：于37 ℃条件下培养24 h后，使大肠杆菌能生长繁殖。在麦康凯琼脂培养基上产生圆形、发酵性的粉红菌落，菌落形态通常呈现边缘整齐、表面光滑、凸起特点。在伊红美蓝琼脂培养基上，大肠杆菌菌落呈现粉红或深红，而其他细菌则呈现紫或无菌落。远藤氏琼脂培养基上，大肠杆菌菌落呈现边缘透明，中央暗红的薄膜状，有时也可能呈现紫黑。在沙门、志贺菌属琼脂培养基上，大肠杆菌菌落呈现透明或淡粉，通常较小且平坦，边缘整齐。与沙门氏菌和志贺菌的菌落相比，大肠杆菌菌落较小且无黑金属表1 药物敏感试验判定标准
抑菌圈直径（mm）敏感度
20以上极敏感
15～20高敏感
10～14中度敏感
9～1低敏感
0不敏感
Disease Prevention
光泽，分离菌株平板及镜检形态见图1。
2.4 生化鉴定结果
根据细菌生化鉴定管结果（表2），发现细菌于葡萄糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、阿拉伯糖生化试管中产生气体和酸味，在尿素、硫化铵、西蒙氏枸橼酸盐和克氏柠檬酸盐的试验结果呈阴性，符合大肠杆菌基本生化特性[4]。
2.5 药物敏感试验结果
如表3所示，大肠杆菌对青霉素、链霉素、阿奇霉素、克林霉素、庆大霉素、左氧氟沙星和麦迪霉素等药物的耐药性较高，而对头孢唑林、头孢拉定、头孢他啶和头孢哌酮等药物的敏感性较强。从细菌多重耐药性分析，耐药率超过60%的抗生素药物共9 种，表明奶山羊腹泻时存在多重耐药问题。3 讨论
被检测出的大肠杆菌的耐药性过强，可能由多种因素引起，如抗生素滥用、环境污染等[5，6]。常见耐药机制包括产生酶类、改变细胞壁和膜结构、细胞内药物转移和排出等。为减少耐药性产生和传播，提出以下预防和措施。
3.1 预防措施
3.1.1 注重营养平衡
注重营养平衡是预防大肠杆菌耐药性过强的重要措施之一。科学配制饲料配方、适时调整饲料种类和用量、注重饲料卫生和质量，可提高奶山羊体质和免疫力，降低患病率和抗生素使用量，从而有效预防大肠杆菌耐药性过强的问题。
3.1.2 建立监测体系
建立大肠杆菌耐药性监测体系，可通过确定监测指标、制定监测方案、收集样品、实验室检测、分析结果和制定措施等步骤实现。定期进行大肠杆菌耐药性监测，有助于及早发现问题并采取措施解决，从而保障健康和生产能力，预防大肠杆菌耐药性过强。
3.1.3 增强科普宣传
科普宣传是预防大肠杆菌耐药性过强的重要手段之一。通过开展宣传教育活动、制作宣传资料、加强媒体宣传及行业自律等措施，可提高奶山羊养殖户和工作人员健康意识和合理用药意识，减少抗生素滥用和乱用，降低大肠杆菌耐药性风险。
3.1.4 接种疫苗预防
预防接种是有效预防大肠杆菌感染的重要手段之一。为确保接种效果，应选择适合的疫苗、确定接种时间和剂量、采取适当的接种方法、定期接种和记录接种情况。这些步骤可提高山羊免疫力，减少感染风险。根据相关研究，建议在生产前2～3 周再次接种六联菌苗（包括羊快疫、猝狙、肠毒血症、羔羊痢疾、黑疫和大肠杆菌病），以达到更好
图1 分离菌株平板及镜检形态
a：麦康凯琼脂培养基；b：伊红美蓝琼脂培养基；c：远藤氏琼脂培养基；d：沙门、志贺菌属琼脂培养基
表2 分离菌生化试验结果
检测项目试验结果检测项目试验结果葡萄糖产酸、产气尿素阴性麦芽糖产酸、产气硫化氢阴性
乳糖产酸、产气西蒙氏枸橼酸盐阴性甘露醇产酸、产气克氏柠檬酸盐阴性
阿拉伯糖产酸、产气
预防效果[7]。
3.2 措施
3.2.1 抗生素
根据药敏试验结果选择敏感的抗生素进行，按疗程和剂量使用，严格遵守医嘱。研究表明[8]，大肠杆菌对磺胺类和链霉素等药物有较高敏感性，因此这些药物可该病。对患有该病的羊只，可根据其体重口服磺胺脒，剂量为5～10 mg/kg·bw，每天分2 次口服，连续使用2～3 天。期间应严格按照医嘱，避免过量或不当使用导致耐药性增加。
3.2.2 支持
针对病情严重山羊进行营养支持、水电解质平衡、体温调节等支持，加强身体免疫力，提高治愈率。
4 结语
山羊大肠杆菌感染是一种常见病，对山羊健康和生产造成影响。笔者所在防疫站进行了大肠杆菌的病原学调查和耐药性分析，发现调查地区山羊普遍存在大肠杆菌感染问题，并且部分细菌菌株存在多重耐药性，表明抗生素滥用和乱用已引起严重耐药性问题。为预防和控制山羊大肠杆菌感染及耐药性问题，本研究提出一系列预防和控制措施，包括合理使用抗生素、加强卫生管理、注重营养平衡、建立监测体系、增强科普宣传、采取疫苗预防等。
参考文献
[1] 平措，达娃普赤，丹增，等.藏西北白绒山羊大肠杆菌的
分离鉴定及其耐药性初探[J].山东畜牧兽医，2022，43
（4）：18-20.
[2] 唐云云，韩瑞，张文波，等.波尔山羊肠外致病性大肠杆菌的
何冰分离鉴定及药敏试验[J].今日畜牧兽医，2022，38（7）：1-3，7.
[3] 马弘财，何冰梅，德吉.扎布耶盐山羊大肠杆菌分离鉴定及
药敏试验[J].畜牧与饲料科学，2019，40（1）：104-107.
[4] 宋庆华.烟台地区猪源大肠杆菌分离鉴定及耐药性分析[J].特
种经济动植物，2022，25（9）：1-3.
[5] 王克勤.柴达木绒山羊羔羊大肠杆菌感染情况及药敏试验[J].
表3 药物敏感试验结果
抗生素类别药物名称抑菌圈直径（mm）
耐药性中度敏感敏感
株数比例（%）株数比例（%）株数比例（%）
头孢类头孢唑林14≤d≤181217.652 2.945479.41头孢拉定15≤d≤201522.061 1.475276.47头孢他啶14≤d≤181319.1257.355073.53头孢哌酮15≤d≤211420.591 1.475377.94
β-内酰胺类抗生素
青霉素15≤d≤204363.244 5.882130.88链霉素10≤d≤144769.1257.351623.53阿奇霉素10≤d≤145377.943 4.411217.65克林霉素10≤d≤145276.4768.821014.71庆大霉素d＜104363.24710.291826.47
喹诺酮类抗生素
恩诺沙星d＜104464.713 4.412130.88左氧氟沙星d＜105479.411 1.471319.12丁胺卡那d＜103247.061217.652435.29环丙新诺明d＜103247.061319.122333.82
氨基糖苷类抗生素
多粘菌素10≤d≤144363.241116.181420.59诺氟沙星d＜102130.88710.294058.82复方新诺明d＜103348.5368.822942.65
大环内酯类抗生素麦迪霉素10≤d≤145479.414 5.881014.71米诺环素d＜103145.59913.242841.18
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