櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄
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南欧大戟叶绿体基因组密码子偏好性分析
余 涛，蒲 芬，管 芹，范 敏
（大理大学药学院，云南大理６７１０００）
摘要：为了揭示南欧大戟叶绿体基因组密码子使用偏性及形成原因，以南欧大戟叶绿体基因组中长度大于３００ｂｐ的非重复蛋白质编码序列为研究对象，利用ＣｏｄｏｎＷ１．４．１、ＣＵＳＰ在线程序等生物信息学分析工具对其密码子偏性及使用模式进行分析。结果表明，南欧大戟叶绿体基因组密码子中相对同义密码子使用度＞１的有３１个，其中以Ａ／Ｕ结尾的占７１％，表明其偏好使用以Ａ／Ｕ结尾的密码子；有效密码子数均值为４６．７４，说明密码子使用的偏好性较弱；ＧＣ１与ＧＣ２呈极显著相关，ＧＣ３与ＧＣ２、ＧＣ１无显著相关性，表明密码子第３位碱基与其他位置碱基的组成有差异；此外，ＥＮＣ与ＧＣ３呈极显著相关，说明密码子末尾碱基组成在一定程度上会影响密码子使用偏好性。ＥＮＣ－ｐｌｏｔ绘图分析、中性绘图分析、ＰＲ２－ｐｌｏｔ偏倚分析结果表明，影响南欧大戟叶绿体基因组同义密码子使用偏性的主要因素是自然选择，但同时也受到突变压力等其他因素的影响；通过建库分析，筛选出ＧＡＵ、ＡＵＡ、ＵＵＧ等１４个最优密码子。研究结果可为开展目的基因优化、物种改良和系统进化分析等研究提供科学参考。 关键词：南欧大戟；叶绿体
基因组；密码子偏好性；最优密码子
中图分类号：Ｓ１８４ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０２３）１５－００３５－０７
收稿日期：２０２２－１１－３０
基金项目：云南省乡村振兴科技专项（编号：２０２２０４ＢＫ０９０３１８）；云南省地方高校联合专项（编号：２０２００１ＢＡ０７０００１－１０４）。
作者简介：余 涛（１９９７—），男，云南丽江人，硕士研究生，主要从事中药资源化学研究。Ｅ－
ｍａｉｌ：２９５８２６３２３０＠ｑｑ．ｃｏｍ。通信作者：范 敏，女，博士，讲师，主要从事中药资源化学研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｆａｎｍｉｎ＠ｄａｌｉ．ｅｄｕ．ｃｎ。
南欧大戟（ＥｕｐｈｏｒｂｉａｐｅｐｌｕｓＬ．）为大戟科（
Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）大戟属（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ）一年生草本植物，原产于地中海沿岸，在我国云南、广西、广东及
台湾等地区均有分布［１］
。民间常用其哮喘、癌症等疾病［
２］
。已有研究发现，南欧大戟含有二萜、三萜、甾醇、黄酮、酚酸和糖类等化学成分［３－５］
，具有抗炎［６］、抗肿瘤［７］、心血管疾病和改善多重耐药性［
８］
等作用。目前，关于南欧大戟的研究主要涉及化学成分、药理活性等方面，在核酸等生物大分子层面的研究较少。笔者所在课题组前期对南欧大戟叶绿体基因组特征和系统发育关系进行了阐
述［９］
，但未对其叶绿体基因组密码子使用偏性影响
因素及使用模式进行分析。
密码子由信使ＲＮＡ上３个连续的核苷酸组成［１０］，又称为遗传密码，是生物体遗传信息传递的载体［１１］。标准的６４种密码子由４个碱基随机组合形成，其中包括不具有编码功能的３个终止密码子和６１个编码２０种氨基酸的密码子［１２］；除甲硫氨酸、氨酸外，其余氨基酸均由１个以上同义密码子编码［１３］。经过不断的进化，不同物种在ｍＲＮＡ翻译的过程中，编码相同氨基酸的不同密码子被选择性地使用，从而形成其特有的使用模式，这种现象被称为密码子使用偏好性（ｃｏｄｏｎｕｓａｇｅｂｉａｓ，ＣＵＢ）［１４］。研究发现，特定基因的功能和蛋白表达水平受密码子使用偏好性的影响［１２］，而ＣＵＢ又受到自然选择、基因表达水平、基因组长度、碱基突变和ｔＲＮＡ丰度等因素的综合影响［１３］。
叶绿体基因组具有规模小、多拷贝、分子结构相对保守［１５］、母系遗传［１０］和序列易获得的特点。近年来，测序技术飞速发展，被广泛应用于系统发育分析、ＤＮＡ条形码鉴别研究和基因工程等领域［１６］。基于叶绿体基因组进行密码子使用模式研究及筛选最优密码子，对于提高遗传转化效率、基因表达水平和物种改良有重要意义［１７－１８］。因此，为了解南欧大戟叶绿体基因组密码子使用偏好性及其形成的影响因素，本研究对南欧大戟叶绿体基因组密码子使用模式进行探讨，并筛选出最优密码子，以期为目的基因优化、物种改良和分子育种等提供科学依据。
１ 材料与方法
１．１ 材料与方法
从云南省大理市（２５°８４′９５″Ｎ，１００°１１′９６″Ｅ）采集南欧大戟新鲜叶片，用液氮速冻后将样品送至上海元莘生物医药科技有限公司进行测序，随后对获得的原始数据进行组装注释，将测序结果提交至美国国家生物技术中心数据库（ＮＣＢＩ），登录号：ＭＺ６７８２４２。南欧大戟叶绿体基因组序列大小为１５９４６６ｂｐ，包含８４条蛋白质编码序列（ｃｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ＣＤＳ），将ＣＤＳ中长度小于３００ｂｐ的基因和重复基因剔除［１８］，最终共获得５２条ＣＤＳ用于后续分析。
１．２ 密码子偏好参数的计算
将筛选到的５２条蛋白质编码序列整合成１个ｆａｓｔａ文件，用ＣｏｄｏｎＷ１．４．１［１９］软件分析，获取南欧大戟叶绿体基因组ＣＤＳ的相对同义密码子使用度（ｒｅｌａｔｉｖｅｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓｃｏｄｏｎｕｓａｇｅ，ＲＳＣＵ）、有效密码子数（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｕｍｂｅｒｏｆｃｏｄｏｎ，ＥＮＣ）等相关信息。不同基因中各个密码子第１、２、３位的ＧＣ含量（ＧＣ
１
、ＧＣ
２
、ＧＣ
３
）和基因序列总的ＧＣ含量（ＧＣ
ａｌｌ
）由ＥＭＢＯＳＳ在线程序ＣＵＳＰ计算得到。
１．３ ＥＮＣ－ｐｌｏｔ绘图分析
以各ＣＤＳ的有效密码子数为纵坐标、ＧＣ
３
为横
坐标绘制散点图，并插入ＥＮＣ
ｅｘｐ
＝２＋ＧＣ
３
＋２９／
［ＧＣ２
３
＋（１－ＧＣ
３
）２］的标准曲线；然后通过公式计算
得到ＥＮＣ期望值（ＥＮＣ
ｅｘｐ
），再利用ＥＮＣ
Ｒａｔｉｏ
＝
（ＥＮＣ
ｅｘｐ
－ＥＮＣ
ｏｂｓ
）／ＥＮＣ
ｅｘｐ
公式获得ＥＮＣ比值
（ＥＮＣ
Ｒａｔｉｏ
）
频数分布情况。结合以上２种分析结果，对密码子偏好性受突变、自然选择的影响程度进行评价［１９］。
１．４ 中性绘图分析
以各ＣＤＳ中密码子第１、２位ＧＣ的平均值
（ＧＣ
１２
）为纵坐标、ＧＣ
３
为横坐标构建坐标系，拟合
ＧＣ
１２
与ＧＣ
３
的线性关系，添加对角线，解析ＧＣ
１
、
ＧＣ
２
和ＧＣ
３
的相关性，以进一步分析密码子使用偏性的影响因素。
１．５ ＰＲ２－ｐｌｏｔ偏倚分析
为了揭示密码子第３位４种碱基的数量和关
系，用计算得到的Ｇ
３
／（Ｇ
３
＋Ｃ
３
）、Ａ
３
／（Ａ
３
＋Ｔ
３
）值分别作为ｘ轴、ｙ轴，绘制散点图，以Ａ＝Ｔ且Ｇ＝Ｃ作为图中心点，基因的偏性程度和方向则用该基因点与中心点的矢量距离表示［２１］。
１．６ 最优密码子的分析
以ＥＮＣ值作为指标，对南欧大戟叶绿体基因组的ＣＤＳ序列进行由高到低的排序，筛选出前后１０％的基因序列，分别构建高、低偏性库。用ＣｏｄｏｎＷ１．４．１软件获取偏性库中密码子的ＲＳＣＵ值，ΔＲＳＣＵ＝ＲＳＣＵ高表达－ＲＳＣＵ低表达；高表达密码子的ΔＲＳＣＵ≥０．０８，高频密码子的ＲＳＣＵ＞１，最优密码子的ΔＲＳＣＵ≥０．０８且ＲＳＣＵ＞１［２２］。
２ 结果与分析
２．１ 密码子的ＲＳＣＵ值分析
对南欧大戟叶绿体基因组中的５２条蛋白质编码序列的ＲＳＣＵ值进行分析，图１结果显示，在６４个编码氨基酸的密码子中，ＲＳＣＵ值＜１的密码子有３１个；ＲＳＣＵ值＝１的密码子有２个，分别为编码Ｍｅｔ、Ｔｒｐ的ＡＵＧ、ＵＧＧ；ＲＳＣＵ值＞１的密码子有３１
个，其中第３位碱基为Ｇ的密码子有８个，第３位碱基为Ｃ的密码子有１个，第３位碱基为Ａ、Ｕ的密码
子有２２个，占比为７１％，表明南欧大戟叶绿体基因组密码子偏好以Ａ、Ｕ
结尾。
２．２ 密码子组成分析
对南欧大戟叶绿体基因组各ＣＤＳ序列的密码子碱基组成情况及ＥＮＣ值进行统计分析。表１结果显示，在各基因序列的密码子中，总ＧＣ含量平均值为３７．８０％，范围为２９．５５％～４６．０４％；密码子第１、２、３位的ＧＣ含量均值分别为４６．７３％、３９．３９％、２７．２８％，范围分别为３３．４４％～５７．５６％、２７．０７％～５６．８３％、１６．９５％～３６．４１％。由此可知，密码子不同位置的碱基数量有差异。在绝大多数密码子中，ＧＣ１、ＧＣ２显著高于ＧＣ３，表明南欧大戟叶绿体基因组密码子偏好以Ａ或Ｕ结尾。南欧大戟各ＣＤＳ的ＥＮＣ值为３８．４２～５５．１４，平均值为
４６ ７４，大于３５［２３］
。由分析结果可知，南欧大戟叶绿
体基因密码子的使用偏性较弱。
对南欧大戟叶绿体基因组密码子参数进行Ｐｅａｒｓｏｎ相关性分析，由图２可知，ＧＣａｌｌ与ＧＣ３、ＧＣ２、ＧＣ１间相关系数分别为０．５２、０．７９、０．８５，Ｐ值均＜０．０１，呈极显著相关；ＧＣ１与ＧＣ２间也呈极显著相关（Ｐ＜０．０１）；而ＧＣ３与ＧＣ１、ＧＣ２之间相
关系数分别为０．２４、０．１３，无显著相关性，表明密码子碱基组成第３位与其他位置间有一定差异，第１、２位间的碱基组成较相似。ＥＮＣ与ＧＣａｌｌ呈显著相关关系，与ＧＣ３呈极显著相关关系，说明密码子末尾碱基组成在一定程度上会影响密码子使用的偏好性。ＥＮＣ
表１ 密码子碱基组成和偏性相关指标
基因ＥＮＣＧＣ１
（％）ＧＣ２
（％）ＧＣ３
（％）ＧＣａｌｌ
（％）ＮａｃｃＤ４４．４１３９．４０３７．２０２６．６０３４．４０５００ａｔｐＡ４７．４４５５．７１４０．１６２８．７４４１．５４５０８ａｔｐＢ４６．４１５６．３１４１．２８２７．８６４１．８２４９９ａｔｐＥ５５．１４５２．９９３９．５５３１．３４４１．２９１３４ａｔｐＦ４８．６４４７．０３３２．９７３４．０５３８．０２１８５ａｔｐＩ４７．６８４９．６０３６．６９２９．８４３８．７１２４８ｃｃｓＡ４３．５５３３．４４３６．５３２３．２２３１．０６３２３ｃｅｍＡ３９．５８３６．２４２７．０７２５．３３２９．５５２２９ｃｌｐＰ
１５０．６９５６．８５３６．５５２６．４０３９．９３１９７ｍａｔＫ４７．７３３６．９０２９．５６２５．９９３０．８２５０４ｎｄｈＡ４４．４７４２．０３３８．４６２０．３３３３．６１３６４ｎｄｈＢ４７．３７４１．９６３８．６３３１．１８３７．２５５１０ｎｄｈＣ４５．２６４２．９８３３．８８２７．２７３４．７１１２１ｎｄｈＤ４８．０６４０．３２３７．７２２７．９４３５．３３５０１ｎｄｈＥ４４．９２３９．２２３４．３１２４．５１３２．６８１０２ｎｄｈＦ４５．５４３４．９９３４．８５２４．２６３１．３７７４６ｎｄｈＧ３８．５１４１．８１３３．３３１６．９５３０．７０１７７ｎｄｈＨ４７．１２５１．０１３５．６１２５．００３７．２１３９６ｎｄｈＩ４７．５０４０．４６３７．５７２７．７５３５．２６１７３ｎｄｈＪ４７．９６５０．９４３５．８５２８．９３３８．５７１５９ｎｄｈＫ４５．７５４２．１９４２．６２２５．７４３６．８５２３７ｐａｆＩ５２．８３４７．９３３９．０５３１．３６３９．４５１６９ｐａｆＩＩ４５．２２４３．７８３９．４６２８．６５３７．３０１８５ｐｅｔＢ
４０．９２
４８．１５
４１．６７
２７．３１
３９．０４
２１６
表１（续）
基因ＥＮＣＧＣ１
（％）
ＧＣ２
（％）
ＧＣ３
（％）
ＧＣａｌｌ
（％）
Ｎ
ｐｅｔＤ３８．４２４８．３５３８．４６２１．４３３６．０８１８２ｐｓａＡ４７．２８５１．８０４３．１４２８．５０４１．１５７５１ｐｓａＢ４７．３８４９．２５４３．２７２９．６６４０．７３７３５ｐｓｂＡ３９．４２４９．７２４３．５０３２．２０４１．８１３５４ｐｓｂＢ４６．４８５４．６２４５．３８２９．６７４３．２２５０９ｐｓｂＣ４５．７７５４．７６４６．１０３０．５２４３．８０４６２ｐｓｂＤ４４．３８５２．２６４３．２２３２．４９４２．６６３５４ｒｂｃＬ４６．８７５７．５６４３．７０２８．５７４３．２８４７６ｒｐｌ２５２．２４４９．８２４８．３６３１．２７４３．１５２７５ｒｐｌ１４５２．５２５２．０３３９．０２２３．５８３８．２１１２３ｒｐｌ１６４２．９０４９．２６５２．９４２３．５３４１．９１１３６ｒｐｌ２０５０．０１３６．９７４３．７０２４．３７３５．０１１１９ｒｐｌ２２４９．６０４０．９８３６．８９２０．４９３２．７９１２２ｒｐｏＡ５０．１１４３．２０３２．３３２４．４７３３．３３３３１ｒｐｏＢ４８．０２５０．１４３７．４４２６．９８３８．１９１０７１ｒｏｐＣ１４８．２２５１．１０３７．４４２６．２８３８．２８６８１ｒｐｏＣ２４８．７３４４．８７３６．６８２６．８５３６．１３１３９３ｒｐｓ２４９．７０４３．８８４３．０４２８．６９３８．５４２３７ｒｐｓ３４２．９６４５．６６３２．８８１８．７２３２．４２２１９ｒｐｓ４５３．２４５１．４９３９．１１２７．２３３９．２７２０２ｒｐｓ７４４．８１５２
．５６４５．５１２３．７２４０．６０１５６ｒｐｓ８４６．３８４２．９６４０．００３１．８５３８．２７１３５ｒｐｓ１１４７．１２５３．９６５６．８３２７．３４４６．０４１３９ｒｐｓ１２４１．５６５２．４２４７．５８２６．６１４２．２０１２４ｒｐｓ１４３９．６４４４．５５４７．５２２７．７２３９．９３１０１ｙｃｆ１５２．７２４０．６６３２．２３３４．０４３５．６４３３２ｙｃｆ２５２．７１４１．７１３３．７５３６．４１３７．２９２２９９均值４６．７４４６．７３３９．３９２７．２８３７．８０３７９．２７与Ｎ（密码子数）未呈显著相关，表明基因序列长度
对密码子使用偏性的影响较弱。
２．３ ＥＮＣ－ｐｌｏｔ绘图分析
南欧大戟叶绿体基因组密码子的ＥＮＣ与ＧＣ
３关联分析结果如图３所示，在标准曲线及曲线附近仅有小部分基因分布，表明该部分基因的实际ＥＮＣ值与期望ＥＮＣ值间差异较小，突变对这些基因序列密码子的偏性起主要作用；其他大部分基因距标准曲线较远，且大多数分布于曲线下方，说明该部分基因的实际ＥＮＣ值与期望ＥＮＣ值间有较大差异，ＣＤＳ序列密码子偏好性受自然选择影响较大。此外，对参试基因ＥＮＣ比值计算分析结果显示，有１５个基因分布在ＥＮＣ比值为－０．０５～＜０．０５的区间，占比为０．２８９；分布
于－０．１５～＜－０．０５、０．０５～＜０．１５、０．１５～＜０．２５、０．２５～０．３５区间的基因分别有３、２７、６、１个，占比分别为０．０５８、０ ５１９、０．１１５、０．０１９（表２），说明基因主要分布在－０．０５～＜０．０５区间外，其偏好性主要受到选择压力的影响。以上结果表明，南欧大戟叶绿体基因组密码子偏好性在受碱基突变压力影响的同时，更多受到自然选择的影响。
２．４ 中性绘图分析
南欧大戟叶绿体基因组５２个ＣＤＳ序列中性绘图分析结果（图４）显示，在对角线上分布的基因为ａｔｐＦ，在对角线下方分布的基因有ｙｃｆ１、ｙｃｆ２，其余基
因则分布于对角线上方，表明绝大多数基因的ＧＣ
３值小于其自身的ＧＣ
１２
值。ＧＣ
１２
、ＧＣ
３
的取值范围分
表２ 南欧大戟叶绿体基因组ＥＮＣ比值频数分布组段组中值频数频率－０．１５～＜－０．０５－０．１ ３０．０５８－０．０５～＜０．０５０１５０．２８９０．０５～＜０．１５０．１２７０．５１９０．１５～＜０．２５０．２６０．１１５０．２５～０．３５
０．３
１０．０１９合计
５２
１．００
０
别为０．３１６６～０．５５４０、０．１６９５～０．３６４１，Ｐｅａｒｓｏｎ相关系数＝０．０４８２，ｒ＝０．２１９５，２个参数呈较低的相关性，表明密码子不同位置的碱基组成存在差异。上述结果说明，自然选择对南欧大戟叶绿体基因组密码子偏性起主要作用。２．５ ＰＲ２－ｐｌｏｔ偏倚分析
采用ＰＲ２绘图对５２条ＣＤＳ序列密码子第３位碱基的使用频率进行分析。图５显示，各基因散布于以０．５为中心的４个象限中，且分布不均匀，表明密码子第３位４种碱基的使用频率有差异；多数基因位于水平中心线下方，表明密码子中碱基使用频率表现为Ｇ＞Ｃ，Ｔ（Ｕ）＞Ａ。若碱基突变为影响密码子使用偏性的唯一因素时，基因应位于中心位置，但分析结果表明，南欧大戟叶绿体基因组密码子的
使用偏性在受到突变影响的同时还受到自然
选择等其他因素的影响。２．６ 最优密码子筛选
将５２条参试基因按ＥＮＣ值的高低进行排序，选取首尾各１０％的基因建立高、低基因表达库，并计算ΔＲＳＣＵ值。表３结果显示，ΔＲＳＣＵ≥０．０８的高表达密码子有２７个，其中包括以Ｇ结尾的１２个密码子，以Ｃ结尾的７个密码子，以Ａ结尾的５个密码子，以Ｕ结尾的３个密码子。筛选ΔＲＳＣＵ≥
０ ０８且ＲＳＣＵ＞１的密码子作为南欧大戟叶绿体基因组的最优密码子，最终共获得１４个密码子，分别为ＧＣＧ、ＧＡＵ、ＧＧＡ、ＧＧＧ、ＡＵＡ、ＣＵＵ、ＵＵＧ、ＡＡＵ、ＣＣＡ、ＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＧ、ＵＣＣ和ＵＣＧ，其中以Ｇ／Ｃ结尾和以Ａ／Ｕ结尾的各占５０％（图１）。
表３ 南欧大戟叶绿体基因组最优密码子分析
氨基酸密码子高表达基因低表达基因数目（个）Ｒ
ＳＣＵ数目（个）ＲＳＣＵΔＲＳＣＵＡｌａ
ＧＣＡ
２５１．０２０１６１．０１６０．００４ＧＣＣ
１６０．６５３６０．３８１０．２７２ＧＣＧ １３０．５３１６０．３８１０．１５０ＧＣＵ
４４１．７９６３５２．２２２－０．４２６Ｃｙｓ
ＵＧＣ
１３０．７４３００
０．７４３
ＵＧＵ２２１．２５７１１２．０００－０．７４３ＡｓｐＧＡＣ
３２０．３８１７０．４８３－０．１０２ＧＡＵ
１３６１．６１９２２１．５１７０．１０２ＧｌｕＧＡＡ
１３３１．３７８４０１．５０９－０．１３１
ＧＡＧ
６００．６２２１３０．４９１０．１３１ＰｈｅＵＵＣ９１０．８９２３００．８２２０．０７０ＵＵＵ
１１３１．１０８４３１．１７８－０．０７０ＧｌｙＧＧＡ
６５１．７９３２５１．３３３０．４６０ＧＧＣ１１０．３０３８０．４２７－０．１２３ＧＧＧ ３００．８２８３０．１６００．６６８ＧＧＵ３９１．０７６３９２．０８０－１．００４ＨｉｓＣＡＣ１９０．４８７６０．４６２０．０２６ＣＡＵ
５９１．５１３２０１．５３９－０．０２６
ＩｌｅＡＵＡ ８１０．９６８２７０．７８６０．１８２ＡＵＣ
５９
０．７０５
１７
０．４９５
０．２１０
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