刘晓柱，李银凤，张远林，曾爽，张松，黄名正
(贵州理工学院食品药品制造工程学院，贵州贵阳550003)
摘要：为分析一株鲜食葡萄来源酵母菌YM7的类别及酿造学特性，采用形态学与分子生物学方法鉴定其种属，以商业化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)XI6为对照，采用光密度法分析其生长特性和生理耐受性，对硝基苯基-0-D毗喃葡萄糖昔显法检测其0-葡萄糖昔酶成能力，亚硫酸F培养法检测其化氢产生能力，并S.cerevisiae X16发酵葡萄汁，评价其对葡萄酒化指标气特性的影响。结果表明，菌株YM7被鉴定为克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)，其生长性能、二氧化硫、柠檬酸耐受性与S.cerevisiae X16接近，葡萄糖耐受性低于S.cerevisiae X?6，可耐受体积分数3%的乙醇，0-葡萄糖＞酶和硫化氢生产能力分别低于、高于S.cerevisiae X16。此外，与S.cerevisiae X16单独发酵葡萄酒相比，该菌株与S.cerevisiae X16混合发酵的葡萄酒挥发酸含量降低，香气化合物中酸类、醇类物质降低，酯类物质加＜
关键词：克酵母；生长性能；耐受性；酿造学特性；混合发酵
中图分类号:TS261.1文章编号：0254-5071(2021)03-0048-06doi:10.11882/j.iss:.0254-5071.2021.03.0
10引文格式：，李银凤，张远林，•鲜食葡萄来源酵母菌的鉴定及其酿造学特性分析!J].中国酿造，2021，40(3)：J-53.
Identification and enology characteristics of y east strain from table grape
LIU Xiaozhu,LI Yinfeng,ZHANG Yuanlin,ZENG Shuang,ZHANG Song,HUANG Mingzheng
(College of F ood&Pharmaceutical Engineering,Guizhou Institute of Technology,Guiyang550003,China)
Abstract:To analyze the species and enology characteristics of yeast strain YM7isolated from table grape,the strain was identified by morphological and molecular biological method,its growth performance and physiological tolerances were analyzed by optical density method with commercial Saccharomyces cerevisiae X16as control.The0-glucosidase and hydrogen sulfide production ability were determined by p-nitrophenyl-0-D-glucopyranoside chromogenic method and bismuth bisulfite culture technology,respectively.In addition,the grape juice was fermented by strain YM7together visiae X16to further evaluate its effect on the physical and chemical indicators and aroma characteristics of the wine.The results showed that the strain YM7was identified as Pichia kluyveri,and its growth performance,sulfur dioxide tolerance and citric acid tolerance were similar to c
visiae X16.Glucose tolerance of the strain YM7was lower visiae X16.The strain YM7could tolerate3%ethanol.The production capacity of0-glucosidase and hydrogen sulfide were higher and lower than that visiae X16,respectively.Moreover,compared with the wine fermented visiae X16, the volatile acid content in wine fermented with the strain visiae X16was reduced,the contents of acids and alcohols in aroma compounds reduced,while the content of esters increased.
Key words：Pichia kluyveri;growth performance;tolerance;enology characteristic;mixed fermentation
葡萄酒的发酵本质上是酵母菌将葡萄糖转化为酒精及其他代谢产物的过程。由于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)发酵性能强，酒精耐受性高，易于控制[2]，因此生产者多采用商业化的纯种S.cerevisiae进行葡萄酒的生产，但酒体的风味特性、典型性以及丰富性通常不如采用非酿酒酵母生产的葡萄酒叫因此，随着人们对非酿酒酵母认识的不断加深，将各类非酿酒酵母用于酒类的生产逐渐成为一种普遍接受的方法问。但一般非酿酒酵母对为敏，因此多采用接种的方@接种接种两种A，既保证了发酵的利进行，又保留了非酿酒酵母的酿特性网＜
克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)是一种普遍存在于各类上非酿酒酵母，P.kluyveri产
类物质方
有较大的优势!10#。研究发现，P.kluyveri与S.cerevisiae混合发酵加葡萄酒中高的叫采用P.kluyveri生产的酒，强的典型风味[12]；LU Y Y等问探讨了接种P.kluyveri对榴莲果酒的影响，结果表明，接种接种P.kluyveri发酵的酒乙
的加，物质加丰富＜
此，P.visiae发酵，以
高发性的[14#P.kluyveri
收稿日期：2020-11-03修回日期：2020-11-30
基金项目：贵州省科技计划项目(黔科合平台人才[2017]5789;[2018]5603)；贵州理工学院高层次人才科研启动项目(XJGC20190625)；贵州省教育厅创新体KY[2017]046)
作者简介：1984-)，男，，博士，方向为酿酒微生物资源的挖掘与应用。
因此，本研究采用形态观察及分子生学对鲜食葡萄来源菌株YM7菌种定，S.cerevisiae X16对，酵性能、生长特性、耐受性、酒精耐受性、二氧化硫耐受性、酸耐受性0-葡萄、硫化生产能对其酿造学特性分而其与S.cerevisiae X16酵葡萄汁，分其对葡萄酒基本特性的，期葡萄酒生产潜
在的酵母菌株，对改善葡萄酒品质特性具有重要意义。1材料与方法
1.1材料与试剂
1.1.1菌株
菌株YM7：分离自阳光玫瑰(Shine Muscat)葡萄，保存于本实验室；商业化的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) X16：法国LAFFORT公司。
1.1.2培养基
WL叫酵母浸粉4g，蛋白豚5g，葡萄糖50g，琼脂20g，储存液A JH2PO413.75g/L,KC/10.625g/L, CaC/23.125g/L,MgSO^7H2O3.125g/L)40mL，储存液B (FeC/32.5g/L,MnSO42.5g/L)1mL，储存液C(0.44g漠甲于10mL无菌10mL分95%乙中) 1mL，定容至1000mL,p H自然,121°C高压蒸汽灭菌15min。
酵母浸出粉月东葡萄糖(yeast extract peptone dextrose, YPD叫酵母10g,20g，葡萄
20g,1000mL,pH。另20g 脂，121C高压蒸汽灭菌15min。
1.1.3主要试剂
葡萄、、酵母、、氧酸(deoxyribonuc/eic acid,DNA Marker、聚合酶链式反应(po/y-merase chain reaction,PCR mix生生上
有限公司；对硝基苯基-0-D-毗喃葡萄™(p-nitropheny/-0-D-g/ucopyranoside,p-NPX：上海源叶生物公司；所有试剂均分纯或生试剂。
1.2仪器与设备
UH5300紫外分光光度计：日本日立公司；PHSJ-3F pH 仪：上海仪电科学仪器有SZM视显微镜：中宁波舜禹仪器有T100PCR仪：美伯乐；GCMS-TQ8040NX气相谱-质谱联用(gas chromatographmass spectrometer,GC-MS)仪：日本岛津仪器有限公司。1.3实验方法1.3.1菌株YM7的鉴定
形态观察菌株YM7划线于WL营养琼脂培养基上，28C倒置72h，记录菌落颜、形态、泽特征，并拍。采用结晶紫对菌株YM7染，学显微镜下，观察细胞形态，拍。
分子生学鉴定：参考HOLM C等+18〕方法提取菌株YM7的DNA作模板，通用引物NL1NL4对菌株的26
S rDNA D1/D2区域基因序列进行PCR扩增,PCR扩增产物采用1%凝胶电泳检测。格的PCR扩增产物送生工生上有测序，测序结果提交至美国国立生物技术信息中心(national center for biotechno/ogy information,NCBD的GenBank数据库中进行BLAST同源序列搜索比对。选取同源性较的模菌株的26S rDNA D1/D2区域基因序列，采用MEGA X软件中的邻接(neighbor-joining)法构建系统发育树。
1.3.2菌株YM7的酿造学特性分析
(1)生长曲线测定
将供试菌株YM7与酿酒酵母X16分别以终浓度为108CFU/mL的接种量接种至YPD液体培养基中，28C、180r/min,4h取样一，3次，在波长600nm测定菌液的OD«0＞皿值。共计取10，取时间40h。以各培养时间(x)为横坐标,OD a)0皿值(y坐标绘制菌株的生长线。
2酵试
试菌株YM7以终浓度为108CFU/mL的接种量分接种于2%的葡萄、、、乳、乳的0.6%的酵母浸粉溶液中，酵母置于的试管中，菌株X16对，28C48h，观察
有。有气泡产生，记+性反应,，记-性应。
3生耐受性定
葡萄糖耐受性试菌株YM7以终浓度为108CFU/mL 的接种接种于葡萄度分100g/L、150g/L、200g/L、250g/L、300g/L的Y PD液体培养基中，
验3，以菌株X16为对照组,28C、180r/min培养34h。培养结，在波长600nm测定菌液的OD^皿值。
酒精耐受性：将供试菌株YM7度为108CFU/mL 的接种接种于酒精分分3%、6%、9%、12%、15%的YPD中，平行重复实验3次，以菌株X16对,28C、180r/min34h。结，在波长600nm处测定菌液的OD sd皿值。
SO2耐受性试菌株YM7以终浓度为108CFU/mL 的接种接种于SO2度分50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L、300mg/L的YPD液体培养基中，平行重复实验3，以菌株X16为对，28°C、180r/min培养34h。培
养结束后，在波长600nm处测定菌液的O值。
酸耐受性：将供试菌株YM7以终浓度为］0*CFU/mL的接种量分别接种于含不同柠檬酸质量浓度(15mg/L、20mg/L、25mg/L、30mg/L)的YPD液体培养基中，平行重复实验3次，以菌株X16为对照组,28!、180r/min培养34h。培养结束后，在波长600nm处测定菌液的OD^血值。
(4)
/3-葡萄糖f酶酶活测定
采用p-NPG法分析供试菌株YM7产3-葡萄糖f酶的能力叫酶活力单位定义：在40!、pH5.0条件下,1min水解p-NPG产生1"molp-NP所需酶量为一个酶活力单位,U/mL。
(5)测定
取10"L菌体浓度为108CFU/mL的供试菌株YM7的菌液酸培养基表面的无菌，液体完全吸收后,28!倒置培养5山观察滤纸片变情况。以菌株X16为对照组，菌株产能力，分别为、、、不显凹。
1.3.3葡萄酒的制备B20】
取新鲜的北红葡萄汁(带皮压榨)，加入50mg/L的SO?和600mg/L的基酸菌处理，糖糖度24o Bx分组，置于2L无菌中，
组平行重复3次。第一组组)：接种107CFU/mL的菌株X16 组组)：同时接种108CFU/mL的菌株YM7和107CFU/mL的菌株X16,26!静置发酵。
1.3.4葡萄酒指标的测定
(1的测定
参考GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》测定葡萄酒酒精度、总酸酸含量。采用的
法㈤测定葡萄糖含量。
(2)：分测定国
采用顶空固相微萃取(headspace solid phase microextraction,HS-SPME)结合GC-MS法测定葡萄中的香气成分。美国国家标准与技术研究院(national institute of standards and technology,NIST)14.L标准谱库检索并匹配GC-MS采集得到的数据，进行定性分析。以环己273.5mg/L)为内物，采用内标法进行气物质的定量分析。
1.3.5数据分析
采用Excel2007对数据进行整理和作图，数据结以“平均值土标准差”表示。Adobe Photoshop CS辅助作图。
2结果与分析
2.1菌株YM7的鉴定
2.1.1形态观察
菌株YM7的菌落及细胞形态见图1。由图1可知，菌株YM7在WL营养琼脂培养基上的菌落呈黄白，平铺，边缘不整齐，有褶皱，不透明；细胞近似椭圆状、出芽生殖。根据菌落形态细胞形态，初步鉴定菌株YM7为毕赤属B23C。
图1菌株YM7的菌落(a)及细胞(b)形态
Fig.1Colony⑻and cell(b)morphology of strain YM7
2.1.2分子生物学鉴定
基于26S rDNA基因序列构建菌株YM7的系统发育树，结见图2。由图2可知，菌株YM7毕赤Pichia kluyveri)菌株JE-22(JQ771710.1)聚于一支，亲缘关系最近，结合形态观察结，鉴定菌株YM7为克鲁维毕赤(Pichia kluyveri)。
721—YM7
97L_Hchia kluyveri strain JE-22(JQ771710)
_____________1°°--------Candida ethanolica strain YLL17(MF979225)
----------------Rhodotorula mucilaginosa strain C672(EU386766.1)
-------Torulaspora delbrueckii strain PMM09-1546-AL(KP132792.1)
-------------Hanseniaspora uvarum strain UOA/HCPF8187(KC254055.1) 57---------------Zygoascus meyerae strain UOA/HCPF12067(HM450996.1) ____ 的-------Pichia f ermentans strain YLL1(MF979231)
ooJ
图2基于26S rDNA D1/D2区域序列菌株YM7的系统发育树Fig.2Phylogenetic tree of strain YM7based on26S rDNA D1/D2 domain sequenee
2.2菌株YM7的酿造学特性
2.2.1菌株YM7的生长曲线
菌株YM7的生长曲线见图3。由图3可知，菌株YM7的迟滞期为0〜4h，对数生长期为4〜8h,8h后进入稳定期，迟滞期、对数生长期与菌株X16的基本一致。在稳定期的20h以后，菌体浓度略低于菌株X16。因而，菌株YM7与商业菌株S.cerevisiae X16的生长性能较为似。
Fig.3Growth curves of strains X16and
酿酒葡萄
YM7
222菌株YM7的糖代谢能力
糖代谢实验结果表明，菌株YM7可利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖和半乳糖进行发酵。
223菌株YM7的生理耐受性
菌株YM7的生理耐受性实验结果见图4。
与菌株X16，“*”表P V0.05),
“**”表 P V0.01)。下同。
图4菌株X16与Y M7的生理耐受性实验结果
Fig.4Results of physiological tolerances tests of strains X16and YM7
由图4可知，菌株YM7可耐受300g/L的葡萄糖，但菌体OD血血值随着葡萄糖质量浓度的增加有降低的趋势，且在各种葡萄糖质量浓度下，菌体OD/0）血值均低于菌2X16；菌株YM7可耐受体积分数3%的乙醇，当乙醇体积分数为6%时，菌体OD/o^值迅速降低，当乙醇体积分数达到9%，菌体无法生长，
在各种乙醇体积分数条件下菌体0D/o^值均低于菌株X16；菌株YM7二氧化硫耐受性与柠檬酸耐受性与X16为，P90.05）。
2.2.4菌株YM7产!-葡萄糖昔酶能力
用p-NPG法分菌株YM7的！-葡萄糖背酶产生能力，结果见表1。由表1可知，菌株YM7的胞外酶及胞内酶均低于菌株X16（P V0.01），细胞酶与菌株X16无显著差异（P〉0.05）。
表1菌株X16及YM7的0-葡萄糖9酶产生能力测定结果Table1Determi natio n results of0-glucosidase product i on ability of strains X16and YM7
菌株
胞外酶/胞内酶/胞壁酶/
(mU・mL-i)(mUmL-1)mU mL-1 X1625.41±0.369.15±0.3312.14±0.49
YM713.57±0.47** 4.45±0.42**13.16±0.26 2.2.5菌株YM7产硫化氢能力
菌株YM7的硫产生能力见图5。由图5可知，菌株YM7的，且菌株X16，，明菌株YM7产硫的能力于菌
株X16。硫种具有的体，体有的[19]0菌株YM7产硫量高于S.cerevis说X16，期可结合各种种，菌株进行改造，在的。
A〜B为菌株X16；C〜D为菌株YM7。
图5菌株X16及YM7硫化氢产生能力测定结果Fig.5Determination results of hydrogen sulfide production ability of strains X16and
YM7
2.3葡萄酒检测分析结果
2.3.1理化指标分析
两组葡萄酒的基本理化指标见表2。由表2可知，两组处
理均完成了乙醇发酵，残糖量均＜4 g/L ，酒精度为12.16%vo/〜 12.45%vol 0与酿酒酵母组酒样相比，混合发酵组酒样中总
酸含量升高，挥发酸含量降低，分别为6.17 g/L x 0.29 g/L , 说明菌株YM7可调节葡萄酒中酸类物质含量，包括总酸和 挥发酸。
表2葡萄酒基本理化指标测定结果
Table 2 Determination results of basic physical and chemical indicators
of wine
注：与酿酒酵母组相比,“ ”表示差异显著(P V0.05)。下同。
组别
酒精度/
%vol
残糖量/
(g ・L -1)
总酸含量/
(g ・L -1)
挥发酸含量/
(g ・L -1)酒酵 组
12.45±0.38 3.74±0.31 5.60±0.510.52±0.04
混合发酵组12.16±0.22
3.91±0.35
6.17±0.25
0.29±0.02*
2.3.2香气特性分析
由图6可知，从两组酒样中检测到酸类、醇类、酯类及 其他类物质，两组酒样其他类物质含量无显著性差异(P 〉 0.05)；混合发酵组酒样挥发性醇类物质为127.35 mg/L x 酸 类物质含量为2.78 mg/L ，均低于酿酒酵母组酒样(137 mg/L 、 3.45 mg/L )，挥发性酯类物质含量(75.87 mg/L )高于酿酒 酵母组(64.35 mg/L )。
0.5□酿酒酵母组 固混合发酵组
0 1
I IJ J I I^L..
酸类 醇类 酯类
其他类
图6两组葡萄糖酒样中挥发性香气物质含量测定结果Fig. 6 Determination results of volatile aroma compounds contents in
two groups of wine samples
非酿酒酵母是一大类酿酒酵母之外的多种酵母类 总，由于其
从 的葡萄中 离得到的，因而
一直被认为 染菌， 到 [24]0 酿酒酵
母菌认 ，发
酿酒酵母菌可
物质, 于 酒 物质 性 性,
葡萄酒 质
/
酒酵被于 酒类 ， 菌株
；2527]
。 发
于 葡萄 株 酵母YM7，可调节葡
萄酒酸类物质挥发性 物质质性，因而葡萄酒
中0
3结论
株 葡萄 酵 菌
株
性， 明，菌株YM7为一株 酵
(Pichia kluyveri)，其 性
性 及
酸耐受性 S. cerevisiae X16性
，葡萄糖耐
性低于菌株X16/菌株乙 ，可3%乙，伕葡萄糖
力分别低于、高
于菌株X16。此，与S. cerevisiae X16单独发酵葡萄酒相比，
葡萄酒挥发酸含量，
合物中酸类、类物质含量均
降低，酯类物质含量 。综上,Pichia kluyveri YM7 良好 性、 性发酵特性等 性，初步判断
为一株优良葡萄酒 菌株， 潜 &
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