湖北省地方标准编制说明
标准名称 | 水产品中一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和亚砷酸根的测定高效液相谱-原子荧光光谱法 | 标准起草人 | 姚晶晶 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
起草单位 | 湖北省农科院农业质量标准与检测技术研究所 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1. 项目背景及来源 湖北是千湖之省，境内江河纵横，湖泊水库池塘星罗棋布，发展水产业具有得天独厚的资源优势。全省水域总面积2500万亩，宜养水面1360万亩，居全国第一，其中湖泊养殖、池塘养殖、水库及河沟养殖约各占三分之一。我省水产资源十分丰富。淡水产品总量连续16年雄居全国榜首，适宜发展水产养殖的面积、已养殖面积、池塘养殖面积、人均占有量、淡水渔业科技实力等多项综合性指标均居全国第一。砷广泛存在于地壳、土壤、海水、河水、大气及食物中。不同形态的砷毒性相差甚远，传统砷总量测定不能反映出有关毒性的确切信息，无法满足目前样品分析的需要。故砷的形态分析对于了解砷化物的生态影响及其在环境中迁移转化规律具有重要意义。而不同形态的砷化合物在稳定性上存在差异。故选用适当的预处理技术，以确保样品在分离和富集的过程中砷形态及其组成不发生变化，进而对各形态的砷进行分析检测。 不同形态的砷化物对水产品生长及产量都有明显的影响。因此无论对环境样品、食品，还是对从事与砷有关的工作人员或砷中毒患者的体液进行砷的形态分析都是有必要的。传统方法中，只测定样品中的总砷量，不能给出有关毒性的确切信息。因此，从正确估计砷对环境及人类的危害角度出发，需要建立一种有效地分离、测试各种形态砷化合物的手段。砷的主要几种形态为一甲基砷（MMA）、二甲基砷(DMA)、砷酸根（AsV）以及亚砷酸根（AsⅢ）。 我国目前现行的水产品中砷元素最大允许含量水平较高，而推荐执行的分析方法——ICP-MS法和原子荧光法，具体存在的最主要的问题是没有将有毒的无机砷和无毒的有机砷分开定量，难以符合当今社会对水产品安全的要求。针对砷形态的检测方法标准的空白，制定相应的砷形态检测方法就显得极为重要。 随着我国经济水平和科技水平的发展，高效液相谱仪与其他光谱仪器联用已成为我国各级实验室的基本配套仪器。基于液相谱的分析方法由于灵敏度高，重现性好，常作为仲裁方法。本标准在制定前，查阅了大量的国内外报道的砷形态联合检测方法，依据一甲基砷、二甲基砷、砷酸根、以及亚砷酸根理化性质，针对液相分离、联合提取以及检测条件等三个方面内容，制定了水产品中一甲基砷，二甲基砷，砷酸根以及亚砷酸根的检测方法标准。本标准的实施将有效保障水产品和食品安全。 该项目经湖北省卫生和计划生育委员会批准，由湖北省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所起草。 2. 标准制定的主要过程 成立标准编写小组。 2013年1月，成立了《水产品中一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和亚砷酸根的测定 高效液相谱-原子荧光光谱法》标准编写小组，由彭立军副研究员、李书谦高级农艺师、袁友明副研究员、王明锐副研究员、姚晶晶助理研究员、路磊助理研究员等组成。 完成查新和立项等工作。 于2013年3月向湖北省质量技术监督局递交了《湖北省地方标准——水产品中一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和亚砷酸根的测定 高效液相谱-原子荧光光谱法》的查新报告。本课题组于2013年4月向湖北省卫生和计划生育委员会递交了关于《水产品中一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和亚砷酸根的测定 高效液相谱-原子荧光光谱法》地方标准制定的立项报告。 查阅文献制定方法 查阅砷形态分析方法的资料，在文献资料调研的基础上确定了本标准制定拟采用的原则、方法和技术依据。根据现有报道的砷形态检测方法，分别制定了提取、液相-原子荧光联用分析以及检测条件等三个方面的分析方法。 编写标准征求意见稿和编制说明 2013年10月至2013年11月，编写《水产品中一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和亚砷酸根的测定 高效液相谱-原子荧光光谱法》的标准征求意见稿和编制说明。 方法验证 2013年10月至11月，组织了两家有资质的实验室进行方法验证，两家实验室都具备了分析4种砷形态的仪器设备和相应的前处理设备，统一派发了4种砷标准溶液和标准样品。与2013年11月收回全部的验证报告，2013年11月，进行了数据的汇总和数据的数理的分析工作，并编写完成了《水产品中一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和亚砷酸根的测定 高效液相谱-原子荧光光谱法》方法验证报告。 3. 标准制订的基本原则和技术路线 基本原则 本标准的制订依据《中华人民共和国标准化法》、《中华人民共和国标准化法实施条例》、《湖北省标准化管理办法》的要求，通过查阅大量国内外文献，组织专家论证，拟定实验方案，开展实验，编制标准草案，通过标准验证试验，完成标准征求意见稿经过大量实验验证后编制而成。 （1）本方法能够满足分析四种砷形态特性指标的要求。 （2）本方法的准确度、精密度和灵敏度达到国内、外同类方法的同等水平； （3）建立的标准分析方法符合我国目前检测设备仪器和试剂、材料的供应条件； （4）建立的标准分析方法符合监测行业人员的技术水平，能被国内主要的环境分析实验室所使用并达到所规定的要求； （5）本方法具有普遍适用性，易于推广使用。 技术路线 本标准制订的技术路线图，见图1。 湖北省卫生和计划生育委员会立项 成立标准编制组 查阅相关文献和资料 国内外相关标准的调研 查阅国内外相关分析方法 编写标准制定草案和计划 标准草案 文本制定 完善实施线路 实验数据分析汇总 征集专家修订意见 方法验证 确定标准内容 编制标准方法文本和编制说明 （征求意见稿、征求意见并汇总处理、送审稿、技术审查以及完成报批稿） 国家相关标准 地方和行业标准 4. 方法研究报告 方法研究的目标 适用范围 本方法标准适用于水产品中一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和亚砷酸根的高效液相谱-原子荧光光谱测定。 本标准拟达到的特性指标：通过本标准的修订，使方法的检出限、测定下限、精密度和准确度等满足我国水产品卫生标准中对砷最大允许含量的要求。 目标组分 为满足我国水产品卫生标准中对砷最大允许含量的要求，本标准可以检测一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和亚砷酸根的含量。实现了四种砷形态的联合检测，在选定的谱柱和分析条件下，各组分互不干扰，且有良好的分离度。 方法原理 试样中的一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和亚砷酸根经由50%甲醇溶液提取，浓缩至干，以磷酸二氢铵溶液定容，通过液相谱-原子荧光联用系统分析，保留时间定性，外标法定量。 试剂与材料 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和GB/T 6682中规定的二级水。 甲醇：谱纯。 硼氢化钾。 氢氧化钾。 磷酸二氢铵。 盐酸。 硝酸。 氨水。 一甲基砷标准储备溶液：准确称取适量的一甲基砷标准品，用5%（v/v）硝酸配制成×10-3 g/L的一甲基砷标准储备液，避光保存于4℃冰箱备用。 二甲基砷标准储备溶液：准确称取适量的二甲基砷标准品，用5%（v/v）硝酸配制成×10-3 g/L的二甲基砷标准储备液，避光保存于4℃冰箱备用。 砷酸根标准储备溶液：准确称取适量的砷酸根标准品，用5%（v/v）硝酸配制成×10-3 g/L的砷酸根标准储备液，避光保存于4℃冰箱备用。 亚砷酸根标准储备液：准确称取适量的亚砷酸根标准品，用5%（v/v）硝酸配制成×10-3 g/L的亚砷酸根储备液，避光保存于4℃冰箱备用。 混合标准溶液工作液 取适量四种标准储备液至10 mL容量瓶中，加5%（v/v）硝酸稀释至刻度，现配现用（见表1），如需单独检测，可使用表1中的单一标准溶液。
流动相 取磷酸二氢铵加入1 000 mL水中，用盐酸或者氨水调节pH值为。临用前，过 μm滤膜。 仪器与设备 分析天平，感量 g。 分样筛：孔径 mm。 粉碎机。 漩涡混合器。 超声波震荡仪。 恒温水浴锅。 1 mL 可调移液器。 10 mL棕容量瓶。 50 mL具塞PVC离心管。 2 mL带盖PVC离心管。 μm微孔滤膜（适用于水溶剂）。 μm微孔滤膜（适用于有机溶剂）。 离心机，配有50 mL离心管适配器，RCF不小于2 500g。 氮吹仪。 高效液相泵。 原子荧光光谱仪，配有砷空心阴极灯。 试样制备 对于鲜活或水分含量高的水产品，取有代表性可食用部分500g，捣成匀浆，储存于－18℃以下冰柜中备用。 对于冷冻水产品，解冻后取有代表性可食用部分500g，捣成匀浆，储存于－18℃以下冰柜中备用。 分析步骤 仪器条件与校准 仪器条件 按照仪器说明书的要求进行调试仪器，推荐分析条件： 谱柱：阴离子交换柱谱Hamilton PRP-X100（长250 mm，内径 mm，粒径10μm）； 流速：1mL/min; 进样体积：100μL; 还原剂：%KBH4和%KOH； 载流：7%HCl; 蠕动泵速：70 r/min; 原子荧光条件：灯电流：100mA； 负高压：270V; 载气流量：300mL/min; 屏蔽气流量：600mL/min; 辅阴极电流：30mA。 标准曲线的绘制 移取适量的4种砷的标准溶液，以5%（v/v）硝酸为溶剂配制成5个不同浓度的混合标准溶液，具体浓度见表1。分别移取各标准使用液100μL，注入液相谱中，得到各不同浓度的砷形态谱图。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。 图2 4种砷形态工作曲线 标准样品的谱图
样品测定 取100μL待测样品注入液相泵中。记录谱峰的保留时间和峰面积，根标准方法计算出样品中的待测物含量。 实验条件的选择和方法验证的初步方案 实验条件的选择 （1）谱条件的选择 流动相的pH与混合标准溶液砷形态的分离有关，选取流动相pH为，，来考察其对分离结果的影响，在pH=时，As(III)和DMA两峰出现重叠；PH=时，DMA、MMA分离度下降，并出现严重拖尾现象；在pH=时，4种形态砷物质均能完全分离，且峰形较好，因此流动相pH选取。 （2）载流条件的选择 选取盐酸浓度1%，3%，7%，10%来考察其对结果的影响，HCl浓度越大砷的荧光响应值越大，但基线不稳，噪声较大。当盐酸浓度为10%时，其基线噪声已经严重的干扰样品，而盐酸浓度为7%时，则影响很小。故由实验得当HCl浓度为7%时噪声较小且能够提供较大的响应值。 （3）载气流速的影响 选取载气流速200，300，400 mL/min来考察其对信噪比的影响。当载气流速在200 mL/min时，信噪比较高，灵敏度较高，但背景干扰也较大，稳定性低。载气流速在400 mL/min时，由于载气流速过大导致待分析物质被稀释，灵敏度较低。流速为300mL/min时，灵敏度和稳定性均较适宜，故载气流速选择300 mL/min。 （4）蠕动泵速的影响 选取蠕动泵速60，70，80 r/min来考察其对结果的影响，泵速改变会使经谱柱分离后的砷与还原剂和载流反应的速度发生改变。泵速越大，氢化反应越完全，其灵敏度也越高，但当泵速达到80r/min后，较70r/min而言，其灵敏度没有明显的提高，而且泵速越高还原剂与载流消耗的量也越大，容易造成试剂的浪费，故综合以上分析选取蠕动泵速为70r/min。 （5）提取条件的影响 在本标准的制定初期，实验依据现有的各类分析标准，比较了甲醇、乙腈、丙酮、四氢呋喃、乙酸乙酯、和二氯甲烷等不同溶剂对四种砷形态的联合提取效果，经多次实验，提取液（50%甲醇）可以满足四种砷形态的联合提取。 针对液液分配提取操作复杂，环境污染大的缺点，课题组随后在前期液液分配提取的基础上，查阅了大量外文文献，开发建立了四种砷形态提取技术，比较了甲醇、乙腈、丙酮和乙酸乙酯等有机溶剂对水产品中一甲基砷（MMA）、二甲基砷(DMA)、砷酸根（AsV）以及亚砷酸根（AsⅢ）的提取效果，研究了超声提取、氮吹浓缩的净化效果。实验结果表明，50%甲醇水溶液对四种砷的提取效果较好。 方法检出限的确定方法和验证方案 按照《水产品中一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和亚砷酸根的测定高效液相谱-原子荧光光谱法》样品分析的全部步骤，称取经粉碎、混合均匀的鱼肉样品5g（精确至）于50mL的离心管中，加10mL 50%甲醇溶液，涡旋震荡均匀之后，70℃超声萃取15min，3000r/min离心15min，取其上清液于25mL的比管中，将其沉淀重复上次萃取1次，合并两次上清液，用50%甲醇定容至25mL，取其上清液用滤纸过滤，取滤液5mL，于70℃下吹氮（）浓缩至约，冷却后用流动相定容至，再用过滤膜（）过2次膜。上机检测。以产生仪器信噪比2~5倍响应值所对应浓度（含量）的样品进行重复7次平行测定，计算测定结果的标准偏差，按照公式（1）计算方法检出限，并以3倍方法检出限作为方法的测定下限。 MDL=t(n-1,×S………………………………（1） 式中： MDL为方法检出限； n为样品平行测定的次数； t为自由度为n-1，置信度为99%时的t分布（单侧）； S为n次平行测定的标准偏差。 其中，当自由度为n-1，置信度为99%时的t值可参考表2取值。 表2 t 值表
如果样品的浓度（含量）超过计算出的方法检出限10倍，或者样品浓度（含量）低于计算出的方法检出限，则都需要调整样品浓度重新进行测定。 配制含四种一定浓度的标准溶液，平行测定7次，结果见表3： 表3方法检出限及测定下限
注：一甲基砷（MMA）；二甲基砷（DMA）；亚砷酸根（AsⅢ）；砷酸根（AsⅤ） 方法精密度的确定 按照表4分别在鱼肉样品中添加三个水平的MMA、DMA、AsⅢ和AsⅤ标准品，按照标准步骤处理后，取其样品提取液做精密度测定，每个水平测定6次，结果见表5。 表4测定精密度的各个加标水平（单位：μg/kg）
表5精密度测试结果
方法准确度的确定 加标回收实验 按照表6分别在鱼肉样品中添加三个水平的MMA、DMA、AsⅢ和AsⅤ标准品，每水平设三个平行，按照标准方法的分析步骤进行回收率实验，计算其标准偏差和相对标准偏差，结果见表7。 表6测定准确度的各个加标水平（单位：μg/kg）
表7不同加标水平的回收率（单位：%）
与其它标准对比试验 取4种水产品，分别用本方法以及GB/T23372-2009 中的样品处理方法，按照分析步骤进行样品测定，结果如表8： 表8 2种方法的测试结果（单位：μg/kg）
由4种水产品的2种方法的数据对比知，其算术平均值均小于绝对差值的10%，满足方法准确度的要求。 结果计算 按式（2）计算试样中检测目标物的含量（μg/kg）： (2) 式中： X——试样中检测目标物的含量，以质量分数表示，单位为微克每千克（μg/kg）； C——由标准曲线计算得到的上机试样溶液中目标物浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）； V——浓缩至干后试样的定容体积，单位为毫升（mL）； m——试样的质量，单位为克（g）。 平行测定结果用算术平均值表示，保留三位有效数字。 样品的种类，以及部分样品回收率实验 通过对三文鱼、鲳鱼、白鱼、带鱼、鲻鱼、多宝鱼、大黄鱼、虾、鳊鱼、草鱼、财鱼、鲫鱼、白鲢、刁子鱼、胖头鱼、鲇鱼、莲藕以及海带等18种水产品进行方法实验，均能得到满意的结果。其中部分回收率的结果见表9。 表93种水产品的加标回收率汇总表（%）
5. 方法验证 方法验证过程 通过筛选确定方法验证单位。按照方法验证方案准备实验用品，与验证单位确定验证时间。在方法验证前，参加验证的操作人员应熟悉和掌握方法原理、操作步骤及流程。方法验证过程中所用的试剂和材料、仪器和设备及分析步骤应符合方法相关要求。具体结果见附件1、附件2和附件3。 方法验证数据汇总 方法检出限、测定下限汇总 按照《水产品中一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和亚砷酸根的测定 高效液相谱-原子荧光光谱法》中样品分析的全部步骤，进行7 次平行测定。计算7次平行测定的标准偏差，计算方法检出限，当自由度为6，置信度为99%时，t值为。在3家国家认可实验室对方法检出限和测定下限进行了验证，方法检出限和测定下限的汇总情况，见表10。 表10方法检出限、测定下限数据汇总表（单位：μg/kg）
各实验室的方法精密度 在3家国家认可实验室进行了方法精密度的验证工作。在空白饲料样品中分别加入四种砷形态的混合标准溶液，按照《水产品中一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和亚砷酸根的测定 高效液相谱-原子荧光光谱法》中样品分析的全部步骤，进行分析测定，数据汇总见表11-1～表11-4。 表11-1 实验室间方法精密度验证数据汇总表（MMA）
表11-2实验室间方法精密度验证数据汇总表（DMA）
表11-3实验室间方法精密度验证数据汇总表（AsⅢ）
表11-4实验室间方法精密度验证数据汇总表（AsⅤ）
实验室间方法回收率汇总 在3家国家认可实验室进行了方法准确度的验证工作，其数据汇总见表12。 表12 实验室间方法回收率验证数据汇总表
6. 方法验证结论 本方法验证采用《水产品中一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和亚砷酸根的测定 高效液相谱-原子荧光光谱法》，方法的检出限、精密度和准确度是评价方法水平的主要技术指标，方法验证的结果如下： （1）共4家单位参加了方法验证工作，所得数据均能满足方法要求，没有异常情况。 （2）方法检出限和测定下限： 一甲基砷的方法检出限为μg/kg，测定下限为μg/kg；二甲基砷的方法检出限为μg/kg，测定下限为μg/kg；砷酸根的方法检出限为μg/kg，测定下限为μg/kg；亚砷酸根的方法检出限为μg/kg，测定下限为μg/kg。 （3）方法精密度：精密度通常采用标准偏差或相对标准偏差来表示，方法验证所得测定下限浓度的测得相对标准偏差在26%以内。 （4）方法准确度：主要用加标回收率表示，目前测定要求加标回收率74~94%范围内，方法验证的空白样品加标回收率均在70%以上，同时，对比其他标准方法，其绝对差在10%以内，也符合要求。 附1 验证报告 标准名称：《水产品中一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和 亚砷酸根的测定高效液相谱—原子荧光光谱法》 起草单位：湖北省农科院业质量标准与检测技术研究所 验证单位：农业部微生物产品质量监督检验测试中心（武汉） 2013年11月21日 本试验按照湖北省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所提供的《水产品中一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和亚砷酸根的测定高效液相谱-原子荧光光谱法》地方标准草案方法，对其进行验证，验证内容为：检出限和测定下限；方法精密度；准确度等。 1 试剂 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和GB/T 6682中规定的二级水。 甲醇：谱纯 硼氢化钾 氢氧化钾 磷酸二氢铵 盐酸 硝酸 氨水 一甲基砷标准品：GBW08668 二甲基砷标准品：GBW08669 砷酸根标准品：GBW08667 亚砷酸根标准品：GBW08666 一甲基砷标准储备溶液：准确称取适量的一甲基砷标准品，用5%（v/v）硝酸配制成×10-3g/L的一甲基砷标准储备液，避光保存于4℃冰箱备用。 二甲基砷标准储备溶液：准确称取适量的二甲基砷标准品，用5%（v/v）硝酸配制成×10-3 g/L的二甲基砷标准储备液，避光保存于4℃冰箱备用。 砷酸根标准储备溶液：准确称取适量的砷酸根标准品，用5%（v/v）硝酸配制成×10-3 g/L的砷酸根标准储备液，避光保存于4℃冰箱备用。 亚砷酸根标准储备液：准确称取适量的亚砷酸根标准品，用5%（v/v）硝酸配制成×10-3 g/L的亚砷酸根储备液，避光保存于4℃冰箱备用。 流动相：取磷酸二氢铵加入1 000 mL水中，用盐酸或者氨水调节pH值为。临用前，过 μm滤膜。 2 样品 取市售鲫鱼肌肉部分，纯水冲洗至表面无血污，匀浆后待测。 3 仪器设备 分析天平：感量 g。 粉碎机 漩涡混合器 超声波震荡仪 恒温水浴锅 1 mL可调移液器 10 mL棕容量瓶 50 mL具塞PVC离心管 2 mL带盖PVC离心管 μm微孔滤膜（适用于水溶剂） μm微孔滤膜（适用于有机溶剂） 离心机：配有50 mL离心管适配器，最大转速为4 000 r/min 氮吹仪 高效液相泵 原子荧光光谱仪：配有砷空心阴极灯 4 方法 按照标准草案中提供的方法进行提取、净化；测定 5 结果 检出限与测定下限的确定 按照《水产品中一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和亚砷酸根的测定高效液相谱-原子荧光光谱法》样品分析的全部步骤，以产生仪器信噪比2~5倍响应值所对应浓度（含量）的样品进行重复7次平行测定，计算测定结果的标准偏差，按照公式（1）计算方法检出限，并以3倍方法检出限作为方法的测定下限。 MDL=t(n-1,×S 式中： MDL为方法检出限； n为样品平行测定的次数； t为自由度为n-1，置信度为99%时的t分布（单侧）； S为n次平行测定的标准偏差。 其中，当自由度为n-1，置信度为99%时的t值可参考表1取值。 表1 t 值表
如果样品的浓度（含量）超过计算出的方法检出限10倍，或者样品浓度（含量）低于计算出的方法检出限，则都需要调整样品浓度重新进行测定。 配制含四种一定浓度的标准溶液，平行测定7次，结果见表2： 表2 方法检出限及测定下限
注：一甲基砷（MMA）；二甲基砷（DMA）；亚砷酸根（AsⅢ）；砷酸根（AsⅤ） 方法精密度的确定 按照表3分别在鱼肉样品中添加三个水平的MMA、DMA、AsⅢ和AsⅤ标准品，按照标准步骤处理后，取其样品提取液做精密度测定，每个水平测定6次，结果见表4。 表3测定精密度的各个加标水平（单位：μg/kg）
表4精密度测试结果
方法准确度的确定 按照表5分别在鱼肉样品中添加三个水平的MMA、DMA、AsⅢ和AsⅤ标准品，每水平设三个平行，按照标准方法的分析步骤进行回收率实验，计算其标准偏差和相对标准偏差，结果见表6。 表5测定准确度的各个加标水平（单位：μg/kg）
表6不同加标水平的回收率（单位：%）
结论 灵敏度 本方法中一甲基砷的检出限为μg/kg，检出下限为μg/kg；二甲基砷的检出限为μg/kg，检出下限为μg/kg；砷酸根的检出限为μg/kg，检出下限为μg/kg；亚砷酸根的检出限为μg/kg，检出下限为μg/kg。 精密度 本方法中一甲基砷在各浓度水平下相对标准偏差为≤ %；二甲基砷在各浓度水平下相对标准偏差为≤ %；砷酸根在各浓度水平下相对标准偏差为≤ %；亚砷酸根在各浓度水平下相对标准偏差为≤ %。 准确度 本方法中一甲基砷在各浓度水平下回收率在 % ~ % 范围之内；二甲基砷在各浓度水平下回收率在 % ~ % 范围之内；砷酸根在各浓度水平下回收率在 % ~ % 范围之内；亚砷酸根在各浓度水平下回收率在 % ~ %范围之内。 方法评价 本方法利用液相谱—原子荧光联用技术，能够实现对水产品中四种形态的砷同时检测，减少分析时间，降低检测成本。 附2 验证报告 标准名称：《水产品中一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和 亚砷酸根的测定高效液相谱—原子荧光光谱法》 起草单位：湖北省农科院业质量标准与检测技术研究所 验证单位：湖北省农产品质量安全检测中心 2013年11月20日 本试验按照湖北省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所提供的《水产品中一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和亚砷酸根的测定高效液相谱-原子荧光光谱法》地方标准草案方法，对其进行验证，验证内容为：检出限、测定下限、精密度、准确度等。 1 试剂 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和GB/T 6682中规定的二级水。 甲醇：谱纯 硼氢化钾 氢氧化钾 磷酸二氢铵 盐酸 硝酸 氨水 一甲基砷标准品：GBW08668 二甲基砷标准品：GBW08669 砷酸根标准品：GBW08667 亚砷酸根标准品：GBW08666 一甲基砷标准储备溶液：准确称取适量的一甲基砷标准品，用5%（v/v）硝酸配制成×10-3g/L的一甲基砷标准储备液，避光保存于4℃冰箱备用。 二甲基砷标准储备溶液：准确称取适量的二甲基砷标准品，用5%（v/v）硝酸配制成×10-3 g/L的二甲基砷标准储备液，避光保存于4℃冰箱备用。 砷酸根标准储备溶液：准确称取适量的砷酸根标准品，用5%（v/v）硝酸配制成×10-3 g/L的砷酸根标准储备液，避光保存于4℃冰箱备用。 亚砷酸根标准储备液：准确称取适量的亚砷酸根标准品，用5%（v/v）硝酸配制成×10-3 g/L的亚砷酸根储备液，避光保存于4℃冰箱备用。 流动相：取磷酸二氢铵加入1 000 mL水中，用盐酸或者氨水调节pH值为。临用前，过 μm滤膜。 2 样品 取市售鲫鱼肌肉部分，纯水冲洗至表面无血污，匀浆后待测。 3 仪器设备 分析天平：感量 g。 粉碎机 漩涡混合器 超声波震荡仪 恒温水浴锅 1 mL可调移液器 10 mL棕容量瓶 50 mL具塞PVC离心管 2 mL带盖PVC离心管 μm微孔滤膜（适用于水溶剂） μm微孔滤膜（适用于有机溶剂） 离心机：配有50 mL离心管适配器，最大转速为4 000 r/min 氮吹仪 高效液相泵 原子荧光光谱仪：配有砷空心阴极灯 4 方法 按照标准草案中提供的方法进行提取、净化；测定 5 结果 检出限与测定下限的确定 按照《水产品中一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和亚砷酸根的测定高效液相谱-原子荧光光谱法》样品分析的全部步骤，以产生仪器信噪比2~5倍响应值所对应浓度（含量）的样品进行重复7次平行测定，计算测定结果的标准偏差，按照公式（1）计算方法检出限，并以3倍方法检出限作为方法的测定下限。 MDL=t(n-1,×S 式中： MDL为方法检出限； n为样品平行测定的次数； t为自由度为n-1，置信度为99%时的t分布（单侧）； S为n次平行测定的标准偏差。 其中，当自由度为n-1，置信度为99%时的t值可参考表1取值。 表1 t 值表
如果样品的浓度（含量）超过计算出的方法检出限10倍，或者样品浓度（含量）低于计算出的方法检出限，则都需要调整样品浓度重新进行测定。 配制含四种一定浓度的标准溶液，平行测定7次，结果见表2： 表2 方法检出限及测定下限
注：一甲基砷（MMA）；二甲基砷（DMA）；亚砷酸根（AsⅢ）；砷酸根（AsⅤ） 方法精密度的确定 按照表3分别在鱼肉样品中添加三个水平的MMA、DMA、AsⅢ和AsⅤ标准品，按照标准步骤处理后，取其样品提取液做精密度测定，每个水平测定6次，结果见表4。 表3测定精密度的各个加标水平（单位：μg/kg）
表4精密度测试结果
方法准确度的确定 按照表5分别在鱼肉样品中添加三个水平的MMA、DMA、AsⅢ和AsⅤ标准品，每水平设三个平行，按照标准方法的分析步骤进行回收率实验，计算其标准偏差和相对标准偏差，结果见表6。 表5测定准确度的各个加标水平（单位：μg/kg）
表6不同加标水平的回收率（单位：%）
结论 灵敏度 本方法中一甲基砷的检出限为μg/kg，测定下限为μg/kg；二甲基砷的检出限为μg/kg，测定下限为μg/kg；砷酸根的检出限为μg/kg，测定下限为μg/kg；亚砷酸根的检出限为μg/kg，测定下限为μg/kg。 精密度 本方法中一甲基砷在各浓度水平下相对标准偏差为≤ %；二甲基砷在各浓度水平下相对标准偏差为≤%；砷酸根在各浓度水平下相对标准偏差为≤%；亚砷酸根在各浓度水平下相对标准偏差为≤ %。 准确度 本方法中一甲基砷在各浓度水平下回收率在≥%；二甲基砷在各浓度水平下回收率在≥%；砷酸根在各浓度水平下回收率在≥%；亚砷酸根在各浓度水平下回收率在≥%。 方法评价 本方法利用液相谱—原子荧光联用技术，能够实现对水产品中四种形态砷的同时检测，减少了分析时间，降低了检测成本。 、 附3 验证报告 标准名称：《水产品中一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和 亚砷酸根的测定高效液相谱—原子荧光光谱法》 起草单位：湖北省农科院业质量标准与检测技术研究所 验证单位：华中农业大学资源与环境学院 2013年12月27日 本试验按照湖北省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所提供的《水产品中一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和亚砷酸根的测定高效液相谱-原子荧光光谱法》地方标准草案方法，对其进行验证，验证内容为：检出限、测定下限、精密度、准确度等。 1 试剂 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和GB/T 6682中规定的二级水。 甲醇：谱纯 硼氢化钾 氢氧化钾 磷酸二氢铵 盐酸 硝酸 氨水 一甲基砷标准品：GBW08668 二甲基砷标准品：GBW08669 砷酸根标准品：GBW08667 亚砷酸根标准品：GBW08666 一甲基砷标准储备溶液：准确称取适量的一甲基砷标准品，用5%（v/v）硝酸配制成×10-3g/L的一甲基砷标准储备液，避光保存于4℃冰箱备用。 二甲基砷标准储备溶液：准确称取适量的二甲基砷标准品，用5%（v/v）硝酸配制成×10-3 g/L的二甲基砷标准储备液，避光保存于4℃冰箱备用。 砷酸根标准储备溶液：准确称取适量的砷酸根标准品，用5%（v/v）硝酸配制成×10-3 g/L的砷酸根标准储备液，避光保存于4℃冰箱备用。 亚砷酸根标准储备液：准确称取适量的亚砷酸根标准品，用5%（v/v）硝酸配制成×10-3 g/L的亚砷酸根储备液，避光保存于4℃冰箱备用。 流动相：取1.981g磷酸二氢铵加入1 000 mL水中，用盐酸或者氨水调节pH值为。临用前，过 μm滤膜。 2 样品 取市售鲫鱼肌肉部分，纯水冲洗至表面无血污，匀浆后待测。 3 仪器设备 分析天平：感量0.0001 g。 粉碎机 漩涡混合器 超声波震荡仪 恒温水浴锅 1 mL可调移液器 10 mL棕容量瓶 50 mL具塞PVC离心管 2 mL带盖PVC离心管 μm微孔滤膜（适用于水溶剂） μm微孔滤膜（适用于有机溶剂） 离心机：配有50 mL离心管适配器，最大转速为4 000 r/min 氮吹仪 高效液相泵 原子荧光光谱仪：配有砷空心阴极灯 4 方法 按照标准草案中提供的方法进行提取、净化；测定 5 结果 检出限与测定下限的确定 按照《水产品中一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和亚砷酸根的测定高效液相谱-原子荧光光谱法》样品分析的全部步骤，以产生仪器信噪比2~5倍响应值所对应浓度（含量）的样品进行重复7次平行测定，计算测定结果的标准偏差，按照公式（1）计算方法检出限，并以3倍方法检出限作为方法的测定下限。 MDL=t(n-1,×S 式中： MDL为方法检出限； n为样品平行测定的次数； t为自由度为n-1，置信度为99%时的t分布（单侧）； S为n次平行测定的标准偏差。 其中，当自由度为n-1，置信度为99%时的t值可参考表1取值。 表1 t 值表
如果样品的浓度（含量）超过计算出的方法检出限10倍，或者样品浓度（含量）低于计算出的方法检出限，则都需要调整样品浓度重新进行测定。 配制含四种一定浓度的标准溶液，平行测定7次，结果见表2： 表2 方法检出限及测定下限
注：一甲基砷（MMA）；二甲基砷（DMA）；亚砷酸根（AsⅢ）；砷酸根（AsⅤ） 方法精密度的确定 按照表3分别在鱼肉样品中添加三个水平的MMA、DMA、AsⅢ和AsⅤ标准品，按照标准步骤处理后，取其样品提取液做精密度测定，每个水平测定6次，结果见表4。 表3测定精密度的各个加标水平（单位：μg/kg）
表4精密度测试结果
55 方法准确度的确定 按照表5分别在鱼肉样品中添加三个水平的MMA、DMA、AsⅢ和AsⅤ标准品，每水平设三个平行，按照标准方法的分析步骤进行回收率实验，计算其标准偏差和相对标准偏差，结果见表6。 表5测定准确度的各个加标水平（单位：μg/kg）
表6不同加标水平的回收率（单位：%）
结论 5.4.1 灵敏度 本方法中一甲基砷的检出限为 μg/kg，测定下限为 μg/kg；二甲基砷的检出限为μg/kg，测定下限为μg/kg；砷酸根的检出限为μg/kg，测定下限为 μg/kg；亚砷酸根的检出限为μg/kg，测定下限为 μg/kg。 5.4.2 精密度 本方法中一甲基砷在各浓度水平下相对标准偏差为≤ %；二甲基砷在各浓度水平下相对标准偏差为≤ %；砷酸根在各浓度水平下相对标准偏差为≤ %；亚砷酸根在各浓度水平下相对标准偏差为≤ %。 5.4.3 准确度 本方法中一甲基砷在各浓度水平下回收率在≥ %；二甲基砷在各浓度水平下回收率在≥ %；砷酸根在各浓度水平下回收率在≥ %；亚砷酸根在各浓度水平下回收率在≥ %。 5.4.4 方法评价 本方法利用液相谱—原子荧光联用技术，能够实现对水产品中四种形态砷的同时检测，减少了分析时间，降低了检测成本。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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