基因组学与应用生物学，2020年，第39卷，第10期，第4426-443丨页
研究报告
Research Report
基于实时荧光P C R方法的牦牛肉源性成分鉴别
郭华麟1明玥1李轲2时淄航1尤祯丹u蒋玉涵陈传君徐超2韩国全y
1四川农业大学食品学院，雅安,625014; 2郑州海关检验检疫技术中心，郑州,450003; 3四川农业大学食品加工与安全研究所，雅安，625014
* 通信作者，*********************
摘要为了建立牦牛肉源性检测的实时荧光PCR方法，本研宄基于比较牦牛与黄牛、鸡、猪、羊、鸭等动物 的C y A基因序列差异，设计其特异性引物。特异性实验结果表明，猪肉、鸡肉和黄牛肉的DNA均不与引物发 生交叉反应；灵敏度实验表明方法的最低检出限可达0.004 ng/jxL；抗干扰实验结果表明，当牦牛肉的添加量 为1%时仍可检出；对市场上的20份不同种肉样进行检测，除牦牛肉样品检测结果呈现阳性外，其余肉样均 为阴性。本实验所建立的实时荧光PCR方法为牦牛源性成分鉴别提供一种快速、准确、专属性强的检测方法。关键词实时荧光PCR，牦牛肉，鉴别
淄Identification of Yak Beef Origin Components Based on Real-time PCR
Guo Hualin 1Ming Yue 1Li Ke2Shi Zihang1You Zhendan 1,3Jiang Yuhan u Chen Chuanjun u Xu Chao2Han Guoquan
1Food Science College of Sichuan Agricultural University, Ya'an, 625014; 2 Zhengzhou Customs of the People's Republic of China, Zhengzhou, 450003; 3 Institute of Food Processing and Safety of Sichuan Agricultural University, Ya'an, 625014
*Correspondingauthor,*********************
DOI: 10.13417/j.gab.039.004426
Abstract In order to establish a real-time PCR method for detection of yak beef origin,the specific primers are designed based on comparing the sequence differences of Cytb gene between yak cattle,chickens,pigs,sheep,and duck.Specificity test shows that the DNA of pork,chicken and yellow beef do not have a cross react with the primers;sensitivity test shows that the minimum detection limit of the method is 0.004 ng/jxL;anti-interference experiment shows that it can still be detected when the addition of yak is 1%. 20 different meat samples on the market are tested.Except yak meat
samples show positive results,other meat samples are negative.The real-time PCR method established in this experiment provides a rapid,accurate and specific detection method for identification of y ak derived components.
Keywords Real-time PCR,Yak,Identification
牦牛肉的蛋白质含量丰富，营养成分优于其他 种类的牛肉，作为一种优质肉类而广受消费者喜爱 (邱翔等，2010; Doosti et al.，2014; Iwobi et al.,2015)。然而不良商家用黄牛肉、鸡肉、羊肉甚至猪肉等冒充 牦牛肉的情况层出不穷(Yi et al.,2015)。这种行为在 损害消费者利益的同时，也干扰了市场正常秩序的 建立(高敬等，2014；赵新等，2015，食品工业科技，36(1):299-302)。肉制品的掺假问题不仅关乎人民众 自身的经济和健康安全，甚至还会涉及到宗教信仰 (郭燕华等，2017，食品安全质量检测学报，8(5): 1745-1749)。因此，建立一种快速、准确的检测方法用 于鉴定动物制品中的牦牛源性成分具有非常重要的 意义(赵冉，2012，畜牧与饲料科学，33(10): 1-4)。
己有研宄指出，黄牛、水牛、牦牛等物种的鉴定
基金项目：本研究由四川农业大学科研兴趣项目(2018382)和国家质检总局科技计划项目(2016丨K114)共同资助
引用格式：Guo H.L.，Ming Y.，Li K.，Shi Z.H.，You Z.D.，Jiang Y.H.，Chen C.J.，Xu C.，and Han G.Q.，2020, Bioinformatics analysis of potato nucleoside diphosphate kinase gene (NDPKs), Jiyinzuxue Yu Yingyong Shengwuxue (Genomics and Applied Biology), 39 (10): 4426-443丨（郭华麟，明現，李柯，时淄航，尤祯丹，蒋玉涵，陈传君，徐超，韩国全，2020，基于实时荧光PCR方法的牦牛肉源性成 分鉴别，基因组学与应用生物学，39(10): 4426-4431)
基于实时荧光PCR方法的牦牛肉源性成分鉴别4427
是基于对线粒体丨2S RN A的基因扩增、序列比对等 过程完成的，但是操作步骤繁琐、结果的特异性不 强，故不利于基层推n陈冬等,2008；段庆梓等,2017, 食品研宄与开发,38(9): 167-170)。近年来，以DNA 为基础的肉源性检测方法广泛用于食品检测领域 (Hou et al.，2015；郭梁等，2018，食品研究与开发，39 (16): 153-157; Xu etal.，2018)。最具代表性的是聚合 酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法，该 方法有着操作简单、特异性强、灵敏度高且PCR产物 无需电泳等优点，在食品检测中应用较为广泛(何玮 玲，2013; Hafsa et al.，2016)。
运用探针的实时荧光PCR技术在鉴定肉源性上 具有以下优点：经过特定比对后设计出的引物和探 针可减小假阳性的发生概率；即使肉制品经过深度 加工而导致其D N A发生一定程度的裂解，目标基因 的扩增也不会受到影响，可进行快速批量检测，适用 于样品量较大的肉源性检测工作(陈益春等,2017，食 品工业科技,38(17): 330-334：郭梁等，2018，食品研究 与开发，39(16): 153-157)。
作为动物细胞核外的一种特殊的遗传信息承载 体(胡强等,2007，食品科学，28(11): 319-322)，动物线 粒体基因经常被广泛应用于词料、肉制品鉴别和物 种鉴定等研究(李杰等，2011，湖南畜牧兽医，(2): 13-15)。动物线粒体D N A的应用领域较为广泛，近年来，动物 线粒体D N A的研宄日趋完善，己有很多学者通过对
3 000 -
2 500 -
D  2 000 -
|1500 -
1000 -
500 -
0 -
0 10 20 30 40
循环数
Cycles
图1实时荧光PCR检测方法的建立
注:a：实验组1; b：实验组2; c：空白组;d：阴性组
Figure 1Establishment of the Real-time PCR method
Note: a: Test group 1; b: Test group 2; c: Blank group; d: Nega­tive group
检测，结果表明，仅牦牛肉样检测出荧光信号，而猪 肉、鸡肉和黄牛肉均无荧光信号检出(图2)。说明在 所建立的牦牛肉源性检测方法下，只有牦牛肉呈阳 性，其他品种肉呈阴性，特异性表现良好。
1.3实时荧光P C R灵敏度实验
结果表明，以400 ng/|xL、40 ng/|xL、4 ng/(j(_L、0.4 ngVL、0.04 ngVL、0.004 ng/pL 的牦牛肉 DNA样本作为模板时，均能检出焚光信号，而以0.000 4 ng/jxL 的牦牛肉成分D N A作为模板时，未检出荧光信号 (图3)。故在本实验所建立的方法下，检测牦牛肉源 性成分的实验灵敏度可达0.004 ngVL。
动物线粒体D N A上的基因和控制区的部分序列进行物种鉴定和生物学分类(马伊萨兰等,2016)。
本实验建立了实时荧光PCR方法对牦牛源性成 分进行鉴定，并验证该方法的特异性、灵敏度和抗干 扰能力，同时采集市场上的部分肉样进行该方法的 实际应用。本研究旨在克服以往的牦牛源性鉴定方 法的不足，为今后的检测创建科学有效的鉴定方法。1.4实时荧光PCR抗干扰实验
在鸡肉、猪肉、黄牛肉中依次添加50%、25%、10%、5%、1%、0.1%的牦牛肉。分别检测在不同牦牛 肉添加比例下的C t值(图4；图5；图6>。结果表明，当牦牛肉添加量为0.1%时，试验的Ct>30，故所建立 的方法对其他非牦牛肉成分有一定的抗干扰能力，
1结果与分析
1.1实时荧光PCR检测牦牛源性成分
本实验以C t值30为判断依据，经过重复性实 验证明，在此C t设定值下测定的数据稳定性较好，可应用所建立的方法对牦牛肉阳性样品进行方法验 证(图1)。运用所建立的实时荧光PCR技术对牦牛肉
标准品进行检测，试验组1、试验组2结果呈阳性，空 白组和阴性组均未检测出牦牛源性成分。
1.2实时荧光PCR特异性实验
以不同肉类的D N A为模板，进行实时荧光PCR
Cycles
图2特异性试验
注:a，b.猪肉;c，d：鸡肉;e，f：黄牛肉
Figure 2 Specific tests
Note: a,b: Pork; c,d: Chicken; e,f:
Yellow cattle
4428基因组学与应用生物学
0 10 20 30 40
循环数
Cycles
图3灵敏度试验
Figure 3 Sensitivity tests
牦牛肉成分的检出限可达i%，并且随着牦牛肉比例 的增加,c t值逐渐减小。
1.5方法的应用
在所建立的实时荧光PCR方法下，对采自市场 上的肉制品进行实时荧光P C R检测。实验结果表 明，只有四川木里的牦牛肉制品1、牦牛肉制品2结 果呈现阳性，其他肉制品均无牦牛源性成分检出。说 明本实验所建立的方法可以用于市场上的牦牛肉源 性成分检测，有一定的应用价值(图7)。
循环数
Cycles
图4鸡肉，牦牛肉不同比例混合的C t值
Figure 4 The Ct value of chicken and yak meat mixed in different proportions
a 50% 25% 10%
5% 1%
图5猪肉，牦牛肉不同比例混合的Ct值
Figure 5 The Ct value of pork and yak meat mixed in different proportions
循环数
Cycles
图6黄牛肉，牦牛肉不同比例混合的C t值
Figure 6 The Ct value of beef and yak meat mixed in different proportions
2 500 -
2000-
D 1500 -
u-
^1000 -
500 -
0 -
0 10 20 30 40
托牛肉i
Yak 1
耗牛肉2
循环数
Cycles
图7方法在耗牛，黄牛，羊和鸭等肉制品上的应用
注:a,b：黄牛肉制品;c，出羊肉制品；e,f：鸭肉制品
Figure 7 Methods Application in the detection of yak, yellow cat­tle products, mut products and duck producys
Note: a,b: Yellow cattle products; c,d: Mutton products; e,f: Duck products
2讨论
目前食品中肉源性成分的鉴定方法主要有谱 法、酶联免疫吸附测定法(马永征等,2012)、普通PCR 法、实时荧光PCR法、环介导等温扩增法等。常规 PCR和实时荧光PC R方法是中国己颁布的动物源 性成分鉴定标准中常用的方法(李宗梦等,2014，食品 研宄与开发，35(18): 122-127)。相比于常规PCR
技术，实时荧光PCR技术拥有快速、特异性强和灵敏度高 等优点，己在多种肉类的鉴别中得到了初步的应用，是目前检测肉源性成分常用的检测技术之一。
在本研究所建立的实时荧光PCR检测方法下，特异性实验表明，鸡、黄牛、猪源性成分无荧光信号 检出；通过对牦牛D N A模板进行10倍梯度稀释，结 果表明检出限可达0.004 ng^L；同时，对牦牛肉与猪 肉、鸡肉、黄牛肉样的不同比例混合研宄，进一步证 实了该体系具有一定的抗干扰能力，且牦牛源性的 检出限可低至1%。本实验所采用的牦牛肉源性成分 鉴定的PCR
方法，适合于检测机构对牦牛源性成分
基_f实时荧光PC’R方法的牦牛肉源性成分鉴别4429
进行检测，有一定的推广价值和应用前景。
目前，已有很多针对牛肉成分的鉴别研究(丁11311- akiatkrai and Kitpipit,2017；杨华等，2017; Velioglu et al.，2018)，对于牦牛肉的成分鉴定的文献鲜有报道。因此日后的研究可以从牦牛肉源性成分与其他肉源 性成分的多重PCR鉴定方法着手，探索更加快速高 效的牦牛肉成分鉴别方法。本实验中所建立的实时 荧光PCR方法还有待完善，可以从优化反应条件 参数着手，探宄实时荧光PCR反应体系的最优条 件，建立相应的标准曲线，对牦牛肉源性成分进行定 量检测。
3材料与方法
3.1试验材料与仪器
牦牛肉标准品，鸡肉、猪肉、黄牛肉（均购于超 市)，蛋白酶K(中国的宝生物工程(大连)有限公司), Premix Ex 7^(中国的宝生物工程（大连)有限公司）；AB丨7500实时荧光定量P C R仪(美国应用生物系统 公司）；微量分光光度计Nano Drop(美国Thermo公司)；离心机Sorvall Legend(美国Thermo公司)；恒温 孵育器(德国eppendorf公司)。
3.2引物的设计与合成
将牦牛线粒体细胞素b基因(CyM与其他动 物(黄牛，水牛，鸡，猪，羊，鸭等)进行多序列比对，设 计牦牛的特异性上下游引物和探针(表1)，产物长度 为 410 bp。
3.3样品前处理和DNA提取
试样的制备：将冷冻肉放于室温融化后进行制 样，选取肉样8个不同的位置进行取样，研磨成肉糜 样，混合均匀，装入清洁容器中进行标记、备用。
称取己充分破碎的待检样品100 mg，分别置于 1.5 m L离心管中，做好标记。离心管中加入800 (xL 组织裂解液，于65°C温度下水浴30 min，每隔丨0 min 振荡混勾一次。以12 000 r/min转速离心5 min，倒掉上清液，各管分别加入400 p L+异戊 醇（体积比为24:1)混合液，充分混匀。再以转速12 000 r/m in离心5 min，倒掉上清液，于每管中加入 500 p L异丙醇，在室温下沉淀丨〜2 h。重复离心操作，弃上清液。再于70%乙醇中洗涤沉淀一次，倒去液 体，晾干。最后，加入100 (x L的灭菌水，充分溶解沉 淀，放置于-20°C的温度下保存备用。
3.4实时荧光P C R方法的建立
反应体系(25 |jX):Premix Ex12.5 |xL，肉样 D N A模板2pL，上、下游引物及探针各丨|xL，灭菌 水7.5
PL(表2)。实时荧光PC R反应参数：预变性：95°C，30s；变性:5°C,5s，退火/延伸:60°C，60s，共40个循环。
3.5实时荧光P C R方法的验证
为验证引物对于牦牛源性成分的特异性，将牦 牛肉、黄牛肉、猪肉、鸡肉4种动物DNA作为模板进 行实时荧光PCR检测。以C t值30为判断依据，Ct 值<30为阳性,C t值>30为阴性。
利用微量分光光度计NanoDrop测定牦牛肉样品
表2实时荧光PCR反应体系
Table 2 Real-time PCR reaction system
试剂体积((j l L)终浓度
Reagent Volume (fxL)Final concentration Premix Ex Taq (2x)12.5lx
上游引物  1.00.4 (jimol/L Upstream primer
下游引物  1.00.4 jxmol/L Downsream primer
探针
Probe
1.00.4 pmol/L
DNA模板  2.0
DNA template
灭菌水
Sterile water
7.5
总体积25.0
Total volume
表1引物，探针序列
Table 1The sequence of primer and probe
靶基因引物名称引物序列产物长度(bp) Target gene Primer name Primer sequence Product length (bp) Cytb FI TGACCTTCCAGCTCCATCAA410
R1TCACGTCTCGGCAGATATGG
P CY5-CATGGTGAAACTTCGGCTCC-BHQ
4430基因组学与应用生物学
的D N A浓度，将浓度约为400 ng/p L的牦牛肉DNA 进行丨〇倍梯度稀释，分别稀释成40 ng/|xL、4 ng/pL、0.4 ng/|xL、0.04 ng/|xL、0_004 ngVL、0.000 4 ng/|xL，并进行实时荧光PCR检测。以C t值30为判断依据，Ct值<30的最大稀释度即为牦牛肉源性成分检测的 灵敏度。
为确定方法的抗干扰能力，将牦牛肉与鸡肉、猪 肉和黄牛肉按不同比例混合进行PCR成分鉴定。分 别把鸡肉、猪肉和黄牛肉加入到1%、5%、10%、25%、50%的牦牛肉中，充分混匀后，提取混合样的DNA 进行实时荧光PCR检测。
3.6实时荧光P C R方法的应用
从市场上采集牦牛肉、黄牛肉、水牛肉、羊肉和 鸭肉等肉制品样品共20份，分别提取肉样的DNA 并进行实时荧光PCR检测。其中，牦牛肉来自四川木 里，其余肉样来自郑州某超市。
作者贡献
郭华麟、明玥和韩国全是本研究的实验设计和 实验研宄的执行人；郭华麟、明玥和李轲完成数据分 析，论文初稿的写作；郭华麟、李轲、徐超和韩国全参 与实验设计，试验结果分析；韩国全是本项目的构思 者及负责人，指导实验设计、数据分析、论文写作与 修改。全体作者都阅读并同意最终文本。
致谢
本研究由四川农业大学科研兴趣项目(2018382)和国家质检总局科技计划项目(2016IK114)共同资助。
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