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正常菌对人体健康影响的研究进展
张云智，卢洪洲
（复旦大学附属华山医院复旦大学上海医学院内科学系，上海２０００４０）
［关键词］正常菌；生物制剂；微生物；健康
［中图分类号］Ｒ３７［文献标识码］Ａ［文章编号］１６７１—９６３８（２００５）０２—０１８９—０３
正常菌（Ｎｏｍａｌｆｌｏｒａ）是指在正常人体皮肤、
黏膜以及人体与外界相通的各种腔道（如口腔、鼻咽
腔、肠道和泌尿生殖道）等部位寄居，对人体无害的
微生物丛，包括细菌、真菌、螺旋体、支原体等。正常
菌与人的健康和疾病间存在有密切的关系，它们发
挥着很多重要功能，例如刺激人体免疫系统，协助机
体的消化、吸收等功能。随着微生态学的发展和微生
态制剂的研制，人们日益重视对正常菌的研究。
１人体正常茵的形成及分布
１．１人体正常菌的形成正常菌的构建可以
通过多种途径，主要方式有：（１）产道，胎儿在经过母
体产道时产道内的某些微生物可借机侵入胎儿体内
参与正常菌的形成，但该种途径不适用于经剖宫
产分娩的胎儿；（２）胎儿出生后与外界环境中的微生
物接触，某些微生物可以侵入到婴儿体内参与正常
菌的形成，这是人体内正常菌形成的主要途径；
（３）通过母乳喂养，母乳中含有一定量的微生物，它
们通过母乳进入婴儿体内，参与正常菌的形成。
１．２正常菌在人体内的分布及其功能人体内的
微生物主要分布于人的体表和与外界相通的腔道中。
１．２．１存在于体表的微生物是人体的天然屏障，
是人体非特异性免疫的重要组成部分，具有抵御外
界病原体入侵的作用。
１．２．２肠道是最常见的微生物定居场所人们将
肠道看成是开启免疫系统的钥匙【１｜。Ｌ￡帆等人通
过实验证明了肠道内的正常菌可以在基因水平上
影响肠道的正常功能，他们将粪便拟杆菌（Ｂａｃ—
ｔｅｒｏｉｄｅＳｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ，一种参与构成小鼠和人肠
道正常菌的微生物）注入无菌小鼠体内，经过培养
后对小鼠的基因结构进行分析，并与对照组的无菌
［收稿日期］２００４—１０—２５
［作者简介］张云智（１９７８一），男（汉族），黑龙江省安达市人
硕士，主要从事感染疾病的研究。
１８９··综述·
小鼠基因进行了比较，结果显示，注入微生物的小鼠
其编码肠道代谢和免疫功能的基因发生了明显改
变Ｌ２｜。在此基础上，Ｄａｖｉｄ等人利用ＡｆｆｙｍｅｔｒｉＸ
Ｍｕ７４Ａｖ２基因片段提出肠道内存在有编码肠道正
常功能的聚合基因，这些基因的含量从空肠（２６７基
因）到直肠（１３７基因）递减，肠道内的正常菌正是
通过对这些基因进行分子水平的修饰或生物学的加
工来影响肠道的功能，说明宿主和微生物丛之间存
在有相互作用的功能片断∞Ｊ。
肠道黏膜中分布有较多的免疫细胞，而且供血
丰富、富含糖蛋白和核酸，这些物质可以有利于微生
物在肠道中定居。新生儿刚出生时，肠道是无菌的，
出生后２ｈ左右细菌开始进入，并不断演化，断奶以
后婴儿的肠道菌开始接近成年人。肠道菌对外
来致病菌及条件致病菌的入侵具有较强的生物拮抗
作用，且对宿主的营养、免疫、正常肠道结构的维持
等方面也发挥着重要作用。肠道微生物丛对肠道免
疫功能的影响尤为突出，例如不同类型的肠道乳酸
菌可以激活不同的树突状细胞，活化不同种类的Ｔ
细胞，从而改变宿主的防御类型ＭＪ。此外某些微生
物还具有合成维生素的功能，如核黄素、生物素、叶
酸、吡哆醇及维生素Ｋ等，供人体吸收利用。
１．２．３泌尿生殖道中的正常菌正常情况下，女
性泌尿生殖道中的微生物丛对女性泌尿生殖系统具
有自沽作用，尤其是某些细菌的酸性代谢产物所形
成的酸性环境可抵抗多种病原体的入侵。正常男性
泌尿道不含有细菌。
１．２．４其他腔道口腔中的微生物丛具有协助机
体消化的功能，鼻咽腔和上呼吸道中的微生物可以
抵御呼吸道病原体在局部定植。
２正常茵某些危害性的研究
通常，正常菌对于人体无害，但在某些条件下
如菌失调、异位寄生等，正常菌中的某些微生物 万方数据
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是可以致病的。
菌失调是指在应用抗感染药物的过程中，由于体内对药物敏感的细菌被杀灭，而一些对抗感染药物具有耐药性的细菌趁机大量繁殖，引起严重的感染，又称为二重感染。常见的疾病包括假膜性肠炎、败血
症和儿童急性难治性肺炎等Ｌ５Ｊ，通常病情严重、预后较差，需要作紧急处理。目前，预防菌失调的方法主要是合理使用抗菌药物，避免滥用或长期使用；此外，在使用抗菌药物的同时以及发生菌失调后，可适量服用乳酸杆菌制剂（乳酸或乳酸菌素片）、维生素Ｃ及乳糖、蜂蜜、麦芽糖等以利于大肠埃希菌生长；口服叶酸、复合维生素Ｂ、谷氨酸及维生素Ｂ１：以利于肠球菌生长；亦可用健康成人粪滤液保留灌肠，以引入正常菌。
在某些条件下，正常菌中的微生物可以离开其正常的寄生部位，寄生于体内的其他部位，引起疾病，称为异位寄生。ｋｅ等人证实，乳酸菌异位寄生于腹腔时可引起乳酸菌性腹膜炎Ｌ６Ｊ。
３微生态制剂的研究
微生态制剂（ｍｉｃｒＯｅｃｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｍｉ—ｃｒｏｅｃｏｌｏｇｉｃｓ）又称为益生素，是利用正常菌成员联合制成的活的微生物制剂，它可以补充生物体体内缺乏的正常菌，起到维持或调整微生态平衡的作用。微生态制剂除了含有正常菌的微生物外，还含有一切能促进正常微生物生长、繁殖，尤其是调整和恢复正常菌及优势种的物质，这些物质可以是活的生物制剂，也可以是非生命的有机或无机化合物。目前，在人体使用的益生素主要有两类：（１）活菌制剂，利用一些对人体无害，甚至有益的活菌，可以克服菌失调，能够部分取代抗菌药物的防病治病作用；（２）死菌或其代谢产物，有调节肠道菌失调的作用，但疗效较活菌制剂差。
４微生物与人类健康研究领域的热点问题
４．ｊ微生物对人的生理功能潜在影响的研究人们已经通过实验证实，胎儿早期发育对今后的成长有长远的影响。有研究者提出，孕妇营养不良会增加胎儿长大成人后心血管疾病和代谢性疾病的发生率ｒ７Ｊ。母体在怀孕期间患感染性疾病后，相应的诊断和药物都会对胎儿产生影响，例如放射诊断可导致胎儿出生后的抑郁症以及精神分裂症旧Ｊ。正常菌与人体关系密切，而且在人出生后即进入人的体内，这部分微生物对婴儿今后的发育也存在一定的影响。人们已经证实，早期定居于人体的微生物对于人的认知能力、身高、体重等方面的发展都有影响。某些病原体与先天性发育迟缓的相关性已经得到证实，如果儿童在发育阶段有中枢神经系统感染，就会导致许多功能发育障碍∽１０Ｊ。
４．２选择性植入某些微生物给胎儿、婴儿、成人进行特定疾病的预防与科学家对微生物与疾病间的关系有了更多认识。例如，肠道中的某些细菌可以合成降低肠道炎症和疼痛的物质¨ｌ｜，人们通过核磁共振（躲Ｉ）对脑部功能进行研究时证明，这些肠道疾病可以导致患者头痛，那么是否可以在婴幼儿时期通过向肠道内植入某些微生物来减少这类人神经性头痛的发生率呢？相关研究已在进行。
Ｖｏｒｏｂ’ｅｖ【１２Ｊ等人根据肠道内菌失调时可导致严重的腹泻，而双歧杆菌可以纠正菌失调原理，提出在药物中加入前生命期的双歧杆菌，用来成人和儿童的因菌失调而出现的疾病。
在艾滋病发病率较高的国家，例如博茨瓦纳，有近５０％的产妇是ＨＩＶ．１阳性感染者，胎儿在分娩
过程中受到阴道内ＨＩＶ．１感染的危险性相当高。通过研究发现，提高阴道内杆菌的水平可以降低ＨＩＶ一１的感染率。在这些国家，目前使用某些杆菌如鼠李糖乳酸杆菌ＧＲ一１Ｌｌ３｜，或者使用重组的细胞因子激活剂如Ｌ．ｉｅｎｓｅｎｉｉ（分泌２种ＣＤ４Ｔ细胞结合蛋白，可以覆盖ＣＤ４Ｔ细胞上的ＨＩＶ一１结合位点，从而抑制ＨＩＶ一１与靶细胞的结合【１４Ｊ）注入产道内，可以降低分娩过程中胎儿感染ＨＩＶ．１的危险。
在未来，人们或许可以通过给胎儿体内选择性接种某些微生物，使人类可以获得更长的寿命和更高的生存质量。相关学科，例如分子生物学、免疫学、基因工程、机器人技术、影像医学、儿科学、神经病学、行为科学等的高速发展，为我们更好地研究人体内寄生的微生物提供了广阔的研究方法。可以在母体怀孕期间、婴儿期及成人等任何阶段，将某些具有分泌性物质的微生物接种到人体内，以达到某种作用。
总之，微生物尤其是非致病性的细菌与宿主间的关系仍待深人研究。尽管微生物的干预措施无法迅速治愈这些疾病，但是对微生物与人的生存质量的正确理解可以促使我们对某些传统的认识发生转变。我们不要忘记微生物比人类早出现３９亿年，人类不得不逐渐适应微生物的环境才能够生存，而不是也不可能将微生物消灭。
（下转第１３０页）
万方数据
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对有感染性疾病的住院患者，应严格掌握抗菌药物的应用指征，并尽可能在病原学诊断及药敏试验基础上应用敏感抗菌药物，避免经验用药；对入院时无感染性疾病但基础疾病病情危重需长时间住院的患者应积极采取适当的隔离措施，不能为了预防发生感染性疾病而无指征地滥用抗菌药物。
感染前接受介入性诊疗是住院患者发生医院感染的另一个主要危险因素（ＯＲ＝２．９４）。介人性诊疗无菌技术要求高，如果操作者未进行严格洗手消毒，就容易通过这种诊疗途径将致病菌带入患者体内；而且随着留置时间的延长，残留大量营养物质的引流管可成为致病菌繁殖的温床，使患者容易发生感染。叶晓光等ｒ７Ｊ对住院患者的医院感染现况调查分析也发现，严格限制侵入性诊疗操作有利于降低医院感染的发生率。在阿根廷新生儿重症监护室进行为期１年的研究，结果表明，通过提高洗手率可使医院感染率从２０‰降至１２．４％ｏ蚓。所以，应尽量减少介入性诊疗，缩短导管留置时间；同时应对医护人员开展无菌操作的宣传与教育，增强无菌观念，提高洗手合格率。
我们采用分析流行病学的病例对照研究方法，随机选择病例组与对照组，明确定义研究变量并通过查阅客观的原始记录收集资料，在单因素分析基础上采用ｌｏｇｉｓｔｉｃ多元回归模型进行混杂作用与交
互作用的分析，较好地控制了选择偏倚、信息偏倚和混杂偏倚，因此，所获结果较准确、可靠，并定量衡量了危险因素的效应，澄清了以往的一些模糊认识。结果提示，严格把握抗菌药物联合用药指征、规范介入性诊疗是预防和控制医院感染的关键措施。
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ＡｃａｄｓｃｉＵｓＡ，２００３，１００：１１６７２一１１６７７．
万方数据
正常菌对人体健康影响的研究进展
作者：张云智， 卢洪洲， ZHANG Yun-zhi， LU Hong-zhou
作者单位：复旦大学附属华山医院，复旦大学上海医学院内科学系，上海,200040
刊名：
中国感染控制杂志
英文刊名：CHINESE JOURNAL OF INFECTION CONTROL
年，卷(期)：2005，4(2)
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本项研究从5只哺乳期羔羊及9只断奶期羔羊分离肠道正常菌，共选出281株菌进行菌种鉴定.其结果为这些菌属于8个科、11个属的36种菌.共计算出肠道各部位的细菌数.用选出的20个种的46株菌对草、叶、纸(纤维质)、淀粉、玉米、肉渣、蛋白七种材料作了消化试验.对纤怂维、淀粉、蛋白质三种成分的综合消化能力以多粘芽胞杆菌、长双歧杆菌动物亚种为最好.研究结果表明，有益菌及所产生的代谢产物能够抑制病原菌的生长，从而可预防和腹泻.通过对45株菌相互抑制试验、表明肠内各种菌之间存在共生与拮抗的关系.所产生的细菌素抑菌范围广，性能稳定，具有开发和利用的价值.提示了防治腹泻的新型生物制剂的设计方案.
2.期刊论文王仲兵.WANG Zhong-bing微生物制剂对幼兔腹泻的研究-中国预防兽医学报2007,29(6)
本实验从健康家兔肠道正常菌中经分离、鉴定，筛选出3种有益菌种：需氧芽孢杆菌、酵母菌和厌氧乳酸杆菌，经安全试验和药物敏感试验合格后，分别发酵培养，制成复合型微生物制剂再应用到断奶幼
兔中，观察对幼兔体重、消耗饲料量、腹泻发生率等的影响，同时应用微生物制剂腹泻兔，观察其效果.实验表明，应用复合微生物制剂增重效果明显，料肉比分别为4.20:1,50日龄和70日龄的成活率分别为96%和90.67%，第50日龄和第70日龄时腹泻
率为1.33%和4.67%.使用兔源菌种制成的Ⅰ型微生物制剂能够减少家兔的耗料量，体重明显增加，显著降低料肉比；能够较好地预防幼兔腹泻的发生和降低死亡只数，并且制剂的菌种对大多数抗生素没有抗药性，具有促进生长、减少或杜绝药物污染的优点.
3.期刊论文徐同锏.谭炳海.梁靖坤.曹荣峰EM在畜牧生产中的应用与展望-山东畜牧兽医2009,30(2)
EM作为一种纯天然、无公害的生物制剂，在畜牧生产中有广泛的应用价值.EM由多种正常菌微生物制成，在加强肠道防御、防治疾病、提高饲料转化率、提高畜禽产品质量等方面发挥着重要的作用.本文就EM种类及其特点、作用机理、应用现状与发展前景进行简要综述.
4.期刊论文丁倩益生菌制剂的临床应用-天津药学2005,17(1)
广谱抗生素在临床上的大量使用，造成的肠道菌失调成为许多临床问题的诱因.益生菌制剂通过屏障、增强免疫、抑制有害菌等途径，调节、恢复人体正常菌平衡，从而达到预防和此类疾病的目的，临床广泛用于腹泻、消化性溃疡、细菌性阴道炎以及便秘等，是一类安全、有效的生物制剂.本文综述了益生菌制剂的作用机理及其在临床上的主要应用.
5.会议论文温怡袭活菌制剂的临床应用及展望1985
总结了大连市传染病医院活菌剂应用临床情况，近年来应用菌剂的菌种、剂型已增多，主要有促菌生，大肠杆菌，乳酸杆菌，124—146生物制剂
，剂型有粉剂、片剂、胶束、菌液、乳剂等。菌剂用于急性肠道感染时用量较大，可口服，灌肠同用，好转后可减量，对慢性病例疗程较长，用量较小。用于急性肠道感染疗效较好，35例5天疗程的治愈率为71.4℅（25例），各种慢性肠道感染及其它病的疗效较差，治愈率为18.2℅（24/132例）但好转率为73.5℅（97/132例），急性肠道感染的疗效与国内其它报导大致相同。设想可制作在相应部位应用的菌剂，可增加有协同作用的多种菌剂，制作对常用抗生素耐药的菌剂和特殊用途的制剂。（周毓瑶摘）
6.会议论文冯旭.刘秉阳腹泄儿童粪便中双歧杆菌及其相关菌属变动情况的研究1986
了解我国正常儿童和腹泻儿童肠道内双歧杆菌及其相关菌属的变动情况，以期用某一双歧杆菌优势种制成预防和儿童急性腹泻的生物制剂。结果表明，正常儿童肠道内需氧菌与厌氧菌之比为109.19∶1012.88即1∶1000，而腹泻儿童肠道菌出现比例失调，表现为厌氧菌数量下降和需氧菌数量增加。双歧杆菌及有关属，腹泻儿童粪便中厌氧菌数量下降，在阳性检出率上，真杆菌、丙酸杆菌、放线菌等条件致病菌明显增加。本实验发现双歧杆菌属内各不同菌种在肠道中的分布与国外报告相似，而1～5岁健康儿童粪便中检出率较高的种是双叉双歧杆菌、长双歧杆菌和婴儿双歧杆菌。（周毓瑶摘）
7.期刊论文厉丽华.季旭仁.余颖.胡冬青.干方本饲用微生物添加剂对肉鸡生产性能的影响-中国畜禽种业
2009,5(1)
饲用微生物添加剂，又称活菌剂、生菌剂、是以动物体内正常菌为主体的有益微生物经特殊工艺制成的活菌制剂.直接饲用微生物制剂能保持动物肠道内微生态平衡、补充营养成分、防止有害物质的产生、提高机体免疫功能.是一类无毒、无副作用、无毒性残留的新型饲料添加剂.为了验证饲用微生物添加剂对内鸡的增重、防病等方面的效果，也为在本地的养鸡业中大面积椎广微生物添加剂提供科学依据，进行本试验.
布鲁氏菌病是由布鲁氏菌(简称布氏菌)引起的人畜共患传染病，在我国被列为二类传染病。全世界170多个国家和地区每年向WHO报告发病例数50万例。在过去15年中，随着经济政策等多方面的发展，加之各地重视程度的不同，疫区有了新的变化，以致很多发达国家也有流行。在我国布病波及28个省市区，并且近年疫情反弹、死灰复燃，对畜牧经济带来巨大影响，以及对人类健康构成严重威胁。此外，布鲁氏菌是一种标准的生物战剂。由于其独特的生物特征(几个菌细胞即可造成感染)和损伤效应(可通过气溶胶感染并且形成胞内寄生)，早在20世纪50年代布鲁氏菌即被美军列为B类标准生物战剂，从战略和战术上被敌对方使用的可能性很大，这对我国和我军的生物袭击防护能力提出了新的挑战，针对性开展生物
防护成为军事医学的重要任务。虽然对布病的认识已经存在近千年，但是在病原体致病机制、流行病学理论与控制技术、药物、疫苗等领域的研究起步尚晚。目前a.布鲁氏菌病畜用疫苗的安全性和有效性方面存在诸多局限性，而人用疫苗则至今没有一种安全、有效的产品；b.布病临床时间长，耐药问题亦十分严峻。如果选用耐药菌进行生物，防治工作将十分困难；c.生物袭击后大面积疫源地及疫区环境、物品洗消一般普遍采用高效的化学消毒剂进行处理，存在对物品、装备的高度刺激、腐蚀，引起环境污染、病原体抗力增加，生态平衡破坏，环境沈消技术同样亟待突破。因此基于上述三个因素，研制新一代安全、高效、价廉布鲁氏菌病药物成为我军乃至我国的生命科学重要课题。
噬菌体，作为细菌的病毒，能够特异性的感染和裂解细菌。早在上个世纪二十年代，人们首次引入噬菌体来细菌的感染并取得了良好的效果。但随着抗生素时代的来临，这种方法的发展被忽略。近年来各种耐药性菌株的大量出现，使人们再一次把目光集中到了噬菌体上，运用噬菌体，这种细菌的病毒来细菌性疾病，再一次引起了人们的极大关注。但是，由于应用对象和环境的特殊要求以及噬菌体本身生物特性的展现，直接应用天然噬菌体存在一些不足，如宿主菌耐受性，产生变态反应等局限。因此，噬菌体裂解酶的“自外裂解”效应则成为扩大噬菌体生物制剂的应用范畴以及更好的提高其抗菌效应的科学基础。诸多研究表明噬菌体裂解酶具有能够破坏细菌胞壁质的功能，如Nelson等通过体外和在体实验证实噬菌体裂解酶能消除致病性链球菌的携带状态而不破坏正常菌，而且噬菌体裂解酶不会损害固有的黏膜细胞，具有较高的安全性，目前此酶己开始I期临床试验
；
Schuch等研究发现：重组的γ噬菌体裂解酶( PlyG)能引起敏感菌的裂解，并对感染的小鼠治愈率达到76.9％。
布鲁氏菌噬菌体有多种多价裂解型噬菌体株(如Tbilisi，Weybridge，Berkeley，Firenze等)，可直接作用多种布鲁氏菌(含多种R型和S型)宿主细胞壁，效应的高亲和性与种属特异的细胞壁糖基部分有关，推断细菌难以产生对裂解酶的抗性。因此，将其作为、洗消抗菌制剂具有明显的优势，使之有可能成为专门破坏细菌的“生物酶学消毒剂”。
基于此，本文首先对布鲁氏菌噬菌体国际参考株Tbilisi多价噬菌体进行生物性质和分子特征研究，并且针对噬菌体裂解酶进行基于生物信息学技术的结构分析和功能域预测，随后克隆了噬菌体裂解酶全长基因，并成功构建了噬菌体裂解酶重组质粒，随后经表达、纯化获得噬菌体裂解酶融合蛋白。最后，通过对噬菌体裂解酶的体外抑菌活性的鉴定和裂菌动力学分析来探讨其作为抗菌制剂的应用前景。其研究内容和结果主要包括以下几个方面：
1.布鲁氏菌噬菌体Tbilisi的生物性质及分子特征：通过透射电镜技术，噬斑观察，基因组随机扩增多态性分析，TA克隆技术对噬菌体Tbilisi的生物性质和分子特征进行全面分析，确定Tbilisi头部直径为57±2nm，短尾(32±3 nm长)，分类学属于短尾噬菌体科。培养48小时后显示清晰噬斑，大小为2～3mm：基因组DNA分析为短尾病毒科dsDNA噬菌体，经限制性内切酶BamH1酶切产生2条清晰条带，表
明分子量在34.5kb左右。SDS-PAGE全蛋白电泳显示Tb噬菌体含有9条主要结构蛋白，通过已完成的部分基因组分析工作，发现了包括噬菌体裂解功能相关蛋白与噬菌体尾领蛋白等。
2.布鲁氏菌噬菌体Tbilisi裂解作用关键酶的生物信息学分析：通过重点分析获得的类似于噬菌体裂解功能的蛋白，经过BLAST等初步确定为噬菌体裂解酶蛋白；通过跨膜域分析发现存在跨膜结构，推定可能直接对宿主细胞壁产生作用：并结合分子遗传与进化分析，神经网络预测二级结构，通过同源建模技术模拟分析蛋白质三维结构，采用Verify3D，拉氏构象图等方法评价三维结构的准确性，Procheck方法预测氨基酸残基89.2％在预测准确率最高区，9.2％在允许区，1.6％在一般区域(Va120，Asp109，Asn183，和Ser190)，没有残基在错误区域，对噬菌体裂解酶蛋白遗传亲缘关系进行分析，为遗传操作提供目标，为设计新的蛋白质或改造已有蛋白质提供可靠的依据。LzA的最终模型采用了VERIFY3D验证，其结果显示超过90％的氨基酸残基在准确的区域，即认为LzA同源建模模型的质量良好。Ramachandran图分析表明模型中所有氨基酸残基均分布在允许的范围内，模型中蛋白质主链残基的二面角构象合理；Procheck评价表明模型的结构和均方根z值大多在允许范围内，模型较为合理。同时，采用Protean模块，结合Kyte-Doolittle亲水性
，Karplus-Schultz柔韧性，Jameson-Wolf抗原指数，Emini表面可能性方法预测，预测LzA的抗原指数，亲水性，柔韧性及表面可能性区域在肽段上分布比较均匀，并且有部分的重叠，分别为第15-20、81-88、141-150、182-193、251-262、271-280位氨基酸残基，推测这种重叠区域极有可能是LzA的B
细胞抗原表位。为新的药物分子设计提供合理的靶分子及结构。
3.布鲁氏菌噬菌体Tbilisi裂解酶全长基因的克隆：通过对布鲁氏菌噬菌体Tbilisi裂解酶全长基因的扩增，将噬菌体裂解酶全长基因插入原核表达载体pET32a(+)，成功构建了噬菌体裂解酶重组质粒pET32a(+)-LzA。该重组质粒经位于噬菌体裂解酶目的片段5'端的KpnI和3'端Xho I双酶切鉴定后，对重组质粒进行核苷酸测序，结果表明，重组质粒正确构建。
4.布鲁氏菌噬菌体Tbilisi裂解酶全长基因的表达与纯化：将噬菌体裂解酶重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)，获得了表达稳定的噬菌体裂解酶基因工程菌。在制备融合蛋白包涵体的过程中，发现目的蛋白主要以分泌型表达为主，80％的融合蛋白存在于上清中。在上清中目的蛋白的表达量是包涵体表达量的4倍以上。故对融合蛋白上清行非变性的Nj2+-NTA柱亲和层析以及目的蛋白的分子筛层析纯化后，能够获得单一条带的目的蛋白，基本无杂蛋白的存在，蛋白纯度在90％以上。说明采用非变性亲和层析可以实现噬菌体裂解酶融合蛋白的一步纯化。Bradford法测定目标蛋白浓度为10mg/ml。
5.噬菌体裂解酶融合蛋白裂菌动力学观察：用挖孔法测定噬菌体裂解酶对布鲁氏菌的抑菌活性。结果显示，在加入重组噬菌体Tb噬菌体裂解酶蛋白孔中，可形成了直径约为0.5～2cm的透明圆环，而阴性对照的孔中，无透明抑菌环的形成。初步证明噬菌体裂解酶基因蛋白对布鲁氏菌具有一定的裂菌活性。
6.噬菌体裂解酶融合蛋白环境稳定性研究：观察了在不同酸碱性环境下，不同温度和不同离子浓度的条
件下的噬菌体裂解酶环境稳定性。裂解酶的最适pH值为
7.0。-20℃冻存六个月的酶活力约为原来的57.8％；4℃储存六个月的酶活力约为原来的32.1％；25℃储存50天的酶活力约为原来的
14.3％；37℃储存50天的酶活力约为原来的10.7％；50℃保存25min酶活力约为原来的7.9％；65℃保存lOmin的酶活力几乎全部丧失。100mmol/LEDTA对酶没有明显的抑制作用；0-20mmol/LNaCl、0-20mmol/LMgCl2.0-10 mmoULCaCl2、0-10mmol/L ZnCl2对其活性有激活作用；海藻糖作为酶的保护剂，0-200mmol/L海藻糖对酶没有明显的激活或抑制作用。由此认为噬菌体裂解酶环境稳定性较好，存在在外环境中使用的可能性。
综上所述，本研究通过对布鲁氏菌噬菌体Tbilisi的分子特征进行分析，认识其属于dsDNA短尾病毒科噬菌体，存在9条主要的结构蛋白，并且获得了尾领蛋白和噬菌体裂解酶蛋白等重要功能蛋白，结合生物信息学手段描述了布鲁氏菌噬菌体裂解酶的三维结构和功能预测，继而结合分子生物学技术
，扩增到噬菌体裂解酶全长885bp的基因，为制备噬菌体裂解酶融合蛋白奠定了基础；同时，通过对噬菌体裂解酶的表达和纯化，拿到了具有活性的重组噬菌体裂解酶融合蛋白，融合蛋白主要以可溶性蛋白形式存在。获得的融合蛋白经体外活性检测证实，对布鲁氏菌具有一定的裂解活性并描述了裂菌动力学，随着噬菌体裂解酶的作用浓度增加，其抑菌效果越明显，可以形成0.5～2cm的透明抑菌圆环；环境
稳定性评价观察到发挥抑菌效应的最适pH值、储存温度、离子浓度等，为进一步拓展其抗菌制剂的应用前景奠定一定的基础。
9.期刊论文任月.袁杰利乳酸杆菌及其免疫作用研究进展-中国微生态学杂志2005,17(5)
乳酸杆菌是人体肠道和阴道的正常菌，可作为安全的疫苗载体.其本身可调节多种细胞因子的产生，在维持正常菌中起免疫调节作用.作为辅助微生物制剂，乳酸杆菌可用于消化道疾病、泌尿生殖道感染，以及抗肿瘤等，另外与传统的药物相比，被认为是"天然"无副作用的，是一种有应用前途的微生物[1].
10.期刊论文姚晓英.李大金乳酸杆菌的免疫作用-国外医学（微生物学分册）2004,27(5)
乳酸杆菌是人体的正常菌，可作为安全的疫苗载体.其本身可调节多种细胞因子的产生，在维持正常菌中起免疫调节作用.作为辅助微生物制剂，乳酸杆菌可用于消化道疾病、泌尿生殖道感染、先天性过敏症，甚至抗肿瘤，是一种有应用前途的微生物.
1.李小颖.赵东玲胃肠道微生态及微生态制剂在胃肠道疾病中的应用[期刊论文]-西北药学杂志 2009(2)
2.植自勤.李颂明微生态制剂在儿科临床应用[期刊论文]-国际医药卫生导报 2008(5)
3.张莉上呼吸道微生态平衡研究与益生菌制剂[期刊论文]-内蒙古大学学报（自然科学版） 2006(6)
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下载时间：2011年1月8日
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