中图分类号:R151.2;R114;R99文献标识码:A 文章编号:1002-3127( 2021)(M-0015-05• i仑著•姜黄素急性暴露对秀丽隐杆线虫的毒性作用
魏洪鑫|’2,郝丽丽K2,张文静•,韩高超K2,李思成K2,高珊1,李国君以,宁钓宇K2
(1.北京市疾病预防控制中心/北京市预防医学研究中心,食物中毒诊断溯源技术北京市重点
实验室,北京100013; 2.首都医科大学公共卫生学院,北京100069)
【摘要】目的研究姜黄素急性暴露对模式生物秀丽隐杆线虫的急性致死效应,并探究其对线虫生长发育、运动行为和过氧化反应的影响。方法根据姜黄素的急性致死实验结果确定作用剂量(0、2. 5、5、10、20和40 p m〇l/L),对同步化的L4期线虫分别进行处理、测定其体长、体宽、咽泵振动频率、活性氧(R0S)和抗氧化酶的变化。结果根据L4期 线虫急性暴露模型确定姜黄素LC5。为50 p m ol/L。线虫一般指标的结果显示,20和40 p m o l/L的浓度组与对照组相比,体长明显增加(P<0.05);20和40 p m o l/L浓度组身体弯曲频率增加(/"〈O. 01);高浓度组(10、20和40 p m o l/L)咽泵频率减少(P<0.01)。进一步研究发现,2.5组的姜黄素可降低线虫在热应激状态下体内R O S表达量,并提高超氧
化物歧化酶(S O D)、过氧化氢还原酶(C A T)的活性,氧化还原最终产物丙二醛(M D A)的含量也明显增加。结论秀丽
隐杆线虫急性暴露于姜黄素可对其生长发育、咽泵频率产生影响。并且姜黄素能够有效清除线虫在应激状态下产生的过量活性氧,激活体内抗氧化酶,以抵御机体的氧化损伤。
【关键词】秀丽隐杆线虫;姜黄素;急性毒性效应
Toxic effects of acute exposure to curcumin on the nematode C. elegans
W E I Hong-xin1 2,H A O Li-l i1 2,Z H A N G W e n-jing1,H A N Gao-chao1'2,LI Si-cheng1 2,G A O Shan1,
LI Guo-jun1'2,N I N G Jun-yu1'"
(1. Beijing Centers for disease prevention and control/Beijing Research Center for Prevention Medicine^Beijing Key
Laboratory of Diagnostic and Tracebility Technologies for Food Poisoning, Beijing 100013, China;
2.Capital Medical University, Beijing 100069, China)
【Abstract】Objective To study the toxic effect of curcumin on survival, growth and development, oxid
ative reaction in C. elegans. Methods Nematodes at L4 stage were exposed to curcumin ( with the concentration of 0,  2. 5, 5, 10, 20, 40 |xmol/L respectively based on acute toxicity t e s t),the survival ra te, body length and width,pharyngeal pump vibration frequency, head thrash and body bend were recorded. The intensity of ROS and activity of enzymes were measured. Results The result of acute toxicity test reveals the LC50of curcumin to C. elegans is 50 (Jimol/L. For nematodes at L4 stage, compared with control, the curcumin exposure with the concentrations of 20 and 40 (imol/L induced the increase of body lengths and head shaking rate. Pump vibration frequency was decreased at the concentrations of 10,20 and 40 |xmol/L( P<0. 01 ). Furthermore, the exposure of 2. 5 fxmol/L curcumin could reduce the intensity of ROS in nematodes under heat stress. Meanwhile, the increased activities of superoxide and catalase were detected as well as the increased content of MDA. Conclusion Acute exposure to curcumin can affect the growth and development of C. elegans as well as its pharyngeal pump vibration frequency. In addition, curcumin can effectively remove excessive reactive oxygen species produced in nematodes under stress state and activate antioxidant enzymes to resist oxidative damage.
【Key words】Caenorhabditis Elegans; curcumin;Acute toxic effect
姜黄素(Curcumin)相对分子质量较低,是从姜黄 等多种植物根茎中提取出的一种多酚类黄物质m。
至今,大量研究表明姜黄素是一种高效的抗菌剂,并已 显示出对多种慢性疾病(包括多种类型的癌症、糖尿
基金项目:国家重点研发计划(2018YFC1602204)
作者简介:魏洪鑫,硕士研究生在读,研究方向:公共卫生。
通讯作者:宁钧宇.博副研究员.硕士生导师,研究方向:卫生毒理学。病、肥胖症、心血管、肺、神经和自身免疫性疾病)的治 疗活性[2]。姜黄素也是最受欢迎的膳食补充剂之一,已被证明与其他营养品如白藜芦醇、胡椒碱、儿茶素、槲皮素和染料木黄酮具有协同作用[3]。
秀丽隐杆线虫(匚(16?10/71(16出^5 6/呀抓.5,61.6/呀(1似,简称线虫)是一种新型模式生物,具有生命周期短、遗 传背景清楚、结构简单、具有多种遗传修饰等优势。线
虫与人类基因同源性达40%,保守估计有65%的基因 与人类疾病有关[45]。不仅如此,在人类已知的17条 代谢相关信号通路中,线虫已被证明有12条信号通路 与人体相同,其中大部分通路都与物质代谢密切相
关[61。秀丽隐杆线虫凭借独特优势已逐渐应用到毒
性评估之中,许多难以理解的生物学机制也在秀丽隐杆线虫模型中获得了启示,如衰老机制及阿尔茨海默症的发病机制。国际上也有很多基于线虫的资源体系 应运而生,如线虫基因数据库W o r m B a s e、线虫基本信息网站W o r m B o o k等,毒性评估领域已逐渐形成依托秀丽隐杆线虫从生理水平到分子水平的毒理学评价体系。
本研究采用秀丽隐杆线虫L4期成虫作为毒性测试模型,探讨不同剂量的姜黄素暴露对秀丽隐杆线虫的毒性影响,旨在为姜黄素的安全性评价提供毒理学基础数据。
1材料与方法
1.1 主要仪器和材料野生型秀丽隐杆线虫N2由北京市生命科学研究所王晓晨实验室惠赠。H P250S 生化培养箱(武汉瑞华仪器设备有限责任公司);Vartev Geniie2型游润震荡仪(美国Vortek公司);5930 型高速离心机(日本三洋公司);SZ51体式显微镜(日本O l y m p u s公司);Imager M2型正置显微镜(德国 Zeiss公司);姜黄素(C A S:458-37-7),分析纯(纯度 99%)购自美国Sigma-Aldrich公司,分子探针2,7-二 氯二氢荧光素二乙酸酯(H2D C F-D A)购自美国Sigma-Aklrich公司,过氧化物酶类试剂盒购自南京建成生物研究所。
1.2 秀丽隐杆线虫同步化用S-basal溶液将体内含 有大量卵的成虫从N G M培养基上冲洗至15 m l离心 管中,使其自然沉淀,并反复冲洗2次,用配置好的Bleach 裂解液(取 500 |j l1N a C10,500 |x l 10 mol/L
的N a O H,加超纯水(默克Milli-Q®至10 m l,现用现配)涡旋振荡至虫体全部裂解,离心弃上清,在20 t恒温 摇床上培养过夜(转速为1〇〇〇r/m i n)后,可得到L1期线虫。将摇床过夜的L1期线虫在体视显微镜下观察计算L1期线虫密度,之后将离心管平放至15丈的 恒温培养箱中保存。
1.3急性致死实验秀丽隐杆线虫同步化后,在铺有 O P50的N G M培养基上培养40 h可得到L4期线虫,用S-meclium溶液洗下,接种到96孔培养板,显微镜下 观察线虫的存活状态并计数,记为N…。
将浓度分别为 〇、9.375、18. 75、37. 5、75、150、300、600和1200 ixmol/L的姜黄素溶液(D M S0溶解)各 100 |xl接种到96孔板上,对照组加人100 |x l d d H:0+ 最高剂量组含有D M S0溶液的体积。每个剂量组设3 个平行孔。染毒24 h后,再次观察记录每孔中的线虫 存活数,记为14.死亡率=(14-叱)/叱><1〇〇%。死 亡的判断标准为:虫体基本丧失运动能力,咽泵停止运 动,用铂丝多次触碰虫体无反应。
1.4对线虫生长发育的影响根据前期实验结果计算的L C5。,确定姜黄素的暴露浓度为
2.5、5、10、20和40 ixmol/L,实验体系中各组D M S0含量均与最高剂量 组相同,以排除D M S O对结果的干扰,将同步化处理后 的线虫20 T培养40 h后,于96孔板在上述姜黄素浓度 下继续培养24 h后,测定各组线虫的体长和体宽。
体长和体宽的测定方法为制作琼脂糖垫,滴加0.4 mol/L的叠氮化钠10 pi,用钼丝选择20只状态好 的线虫放人其中,待虫体僵直后,盖上盖玻片。在显微 镜下测定每只线虫的体长和体宽。
1.5 对线虫运动行为的影响将同步化至L4期的线 虫,于96孔板中在含各设定浓度姜黄素培养基中培养 24 h,测定不同处理组线虫的身体弯曲频率和头部摆动频率。
身体弯曲频率测定方法:将96孔板中的培养液(包含线虫)转移至不含O P50的N G M板中,每组观察 20只线虫在20 s内身体弯曲的次数。线虫相对于其 身体长轴方向一个波长的运动记为一次身体弯曲。
头部摆动频率测定方法:将%孔板中的培养液转 移至不含O P50的N G M板中,并滴加1滴M9溶液,将 线虫挑至M9溶液当中,每组观察20只线虫在20 S内头部摆动的次数。线虫头部从一侧摆到另一侧再摆回 来记为一次头部摆动的频率。
1.6 对线虫摄食行为的影响使O P50菌液均匀铺满整个N G M培养皿,在各剂量组分别随机计数线虫20只至含O P50的培养皿中。在正置显微镜下将线虫 放大到能够清楚观察到咽泵运动,每只线虫录制视频30 s,然后以8f Ps的速度慢放视频,计算线虫咽泵振动 频率。
1.7 活性氧自由基R O S测定将同步化至L4期的 线虫在含0、
2. 5、5、10、20和40 (imol/L姜黄素培养基 中继续培养24 h后,转移至35丈的温箱中孵育2 h。随后将
线虫转移至装有1ml D C F H-D A荧光探针(1 mmol/L,溶于M9溶液中)的1.5ml E P管中,20 t
孵育30 min 。在正置荧光相差显微镜下观察每只线虫
对照组    2.5 5 10 20 40
姜黄素浓度/(^mol/L)注:与对照组相比,*/><0.05。
图1姜黄素对线虫身体长度的影响
黄素对线虫生长发育产生影响的前提下,进一步观察 姜黄素是否影响线虫运动神经行为。L 4期线虫经姜 黄素处理24 h 后,各浓度姜黄素处理组线虫的头部摆 动频率没有明显差异。与对照组相比,20和 40 pmol /L 姜黄素处理组身体弯曲频率增加,差异有 统计学意义(P c O .O l ,图2)。
25
700600
591.84
594.04 604.65
654.27 676.96
660.65
对照组
2.5
5 10 20
40
姜黄素浓度/(Mmol/L)
注:与对照组相比,**P<0.01。
图2姜黄素对线虫身体弯曲的影响
2.4 高浓度组姜黄素影响线虫摄食行为为进一步 确定姜黄素是否影响线虫的摄食行为,开展秀丽隐杆 线虫的咽泵实验。L 4期线虫经姜黄素处理24 h 后, 测量了各组线虫咽泵的振动频率。结果显示,与对照 组相比,姜黄素高浓度组(10、20和40^111〇1/1^咽泵振 动频率降低,差异具有统计学意义(P <0.01,
图3)。2.5 姜黄素降低线虫体内R O S 的含量基于姜黄素 对线虫一般状态的影响,为了明确姜黄素在氧化应激 状态下对线虫的影响,本研究选取相对安全剂量2. 5 |xmol /L ,进一步测定线虫暴露于姜黄素24 h 后的 体内活性氧(R O S )的变化。将L 4期线虫暴露于姜黄 素染毒24 h 后,测定并比较姜黄素处理组线虫体内
R O S 的表达量。结果显示,同样未暴露于姜黄素组,
热应激状态组的R O S 表达量大于正常状态下的线虫, 提示热应激状态可以增强线虫体内R O S 的表达;同样
的体内荧光,并用Z E N 2012软件获取图像并计算平均 像素密度,观察线虫体内R 0S 表达量的变化。1.8抗氧化指标的测定将同步化至L 4期的线虫在 含姜黄素培养液中继续培养24 h 后,离心(2 500 r /niin ,2 m i n )去除培养液,收集虫体,用S -basal 洗涤线虫2 次并离心去除上清(2 500 r /m i n ,2 m i n );用超声细胞 破碎仪以功率900 W 、破碎时间12 S  (超声3 s ,间隔3 s )破碎虫体,再以5 000 r /m i n 离心10 m i n ,取上清 于新的离心管中,按照南京建成生物工程研究所生产 试剂盒说明书要求,测定线虫中的超氧化物歧化酶 (S O D )、过氧化氢还原酶(C A T )、丙二醛(M D A )的 含量。
1.9统计学方法所有实验均重复3次,采用Excel 2003建立数据库、S P S S 18. 0软件对数据进行统计学分 析,组间差异采用单因素方差分析,两两比较选择
Dunnett -t 检验进行,以P <0. 05为差异有统计学意义。
2结果
2.1姜黄素急性致死实验为了确定姜黄素对秀丽 隐杆线虫的急性毒性,将线虫暴露于不同剂量的姜黄 素24 h 后,计算各组线虫的生存率,利用统计软件
S P S S 里的Probit 函数进行拟合运算,绘制生存曲线
图,确定姜黄素的L C 5() = 50 jimol /L ,实验数据如表1 所示。
表1
不同染毒剂量组急性致死实验
浓度(pmol/L)
供试虫数(只)
死亡只数(只)
03019. 37544318.75471237.542147536211504732300484060052501200
39
39
2.2高浓度姜黄素增加线虫的体长基于线虫的急 性毒性,确定一般指标的染毒浓度为别为〇、2.5、5、 10、20和40 |x m 〇l /L ,且各组D M S O 含量均与最高组相 同。L 4期线虫经姜黄素处理24 h 后,测定线虫的体 长体宽。结果显示,与对照组相比,浓度分别为20和 40 pmol /L 的姜黄素处理组与对照组相比,体长明显 增加,差异有统计学意义(P <〇. 05,图1)。姜黄素对 线虫体宽没有明显影响。
2.3高浓度姜黄素处理组身体弯曲频率增加在姜
5
0 2 1
—(《)毅«««■拉啲
I
o  o  o  o  o
o  o  o  o  o  5 4
3
2 1u n l /采拉
-B 1
• 18 •毒理学杂志 2021 年 2 月第 35 卷第 1 期 J Toxicol February 2021 Vol. 35 No. 1
对照组
2.5 5 10 20 40
姜黄素浓度/Omiol/L)注:与对照组相比,**P<0.01。
图3
姜黄素对线虫咽泵振动频率的影响
在热应激状态下,未暴露于姜黄素组的线虫R O S 表达 量大于暴露姜黄素组的线虫,这说明2. 5 p m o l /L 的姜 黄素可以降低线虫体内R O S 的含量,见图4(如需清 晰的彩图片,请联系编辑部)。
A 正常状态
B 热应激状态
C 姜黄素暴露+热应激
4姜黄素对线虫体内R O S 表达量的影响
2.6 姜黄素提高线虫体内S O D 、C A T 的活力和M D A
的含量观察到2. 5 |xm 〇l /L 姜黄素暴露线虫后会减 少线虫在热应激状态下产生的R O S ,氧化应激能力增 强和氧化损失的减少通常是抗氧化系统酶活性增强的 原因,因此本研究为了明确机体发生的防御机制,进一 步测定热应激状态下秀丽隐杆线虫体内S O D 、C A T 的 活性,和氧化还原最终产物M D A 的含量,结果表明, 2. 5 (jimol /L 姜黄素暴露线虫后S O D 活力增强,C A T 抑 制率降低,M D A 的含量增加,提示姜黄素是通过提高 线虫体内抗氧化防御系统酶活性来清除自由基,从而 抵抗氧化应激,见表2。
表2姜黄素染毒后线虫体内抗氧化酶活性
浓度
SOD 活性CAT 抑制率
MDA 含量((xmol/L)
(U/ml)%(nmol/ml)010. 33±0. 3862. 51±2. 1832. 99±3. 112.5
15.74±1.71*
56. 67±3.71
37. 13±1. 82
注:SOD 活性(U /m l)=(对照组吸光度-测定管吸光度)/对照管吸 光度X2X 反应体系的稀释倍数X 样本测试前的稀释倍数;CAT 抑制率 (%)=(对照组吸光度-测定管吸光度)x271x( 1/60 *取样量)x 样本测 试前稀释倍数;MDA 含量(nm 〇l /m l )=(测定管吸光度-测定空白管吸 光度)/(标准管吸光度-标准空白管吸光度)x 标准品浓度x 样本测试前 稀释倍数。.与O p m o l/L 浓度组比较/P <0.05。
3
讨论
(^阳^等⑴的研究中,以0. 5、1.0和3 g /kg.bw 给予小鼠姜黄非标准提取物,未出现急性死亡,在高浓 度剂量组(3 g /kg *b w )出现中枢神经系统刺激症状。 ¥{;111831^等[8]对小鼠连续14 d 灌胃给予姜黄素,在0.2%和1%剂量组,肝出现毒性效应。体外研究显示 24 |xmol /L 姜黄素急性暴露可降低I C R 小鼠胚泡发育 速度[9]。另一项研究中,24(juti 〇1/L 的姜黄素对ICR 小鼠胚胎致死率100%,浓度为6和12 jjimol /L 的姜黄 素会抑制I C R 小鼠囊胚增殖[1°]。1、10和100 |xg/ml 的姜黄素能引起猪卵巢细胞凋亡,在剂量为100 Ag /
m l 的姜黄素处理组,死亡率是阴性对照组的2倍["]。
本研究中,采用姜黄素的标准品(分析纯规格),选择 新型模式生物秀丽隐杆线虫,利用L 4期线虫开展急性 毒性研究,确定姜黄素的半数致死剂量(L C 5D)为 50 (juno 丨/L 。在线虫一般指标的研究中,发现40 pmol/L 浓度组线虫咽泵振动频率降低。秀丽隐杆线虫的咽部 是一种自成一体的神经肌肉泵,属于摄食器官[12]。咽 泵运动的频率会受到多种神经元和神经递质的控制,
所以如果某种暴露物质影响了线虫活动的运动神经 元,那么线虫的咽泵振动频率就会受到影响。所以咽 泵的运动频率可以反映线虫的摄食相关神经是否受到 了外界物质的影响|13]。本研究发现姜黄素暴露使线 虫的咽泵振动频率减慢,出现摄食障碍,考虑姜黄素可 能对线虫咽泵相关神经和肌肉产生了毒性效应。但实 验观察到高浓度姜黄素增加线虫的体长,考虑可能原 因是虽然外界物质使咽泵振动频率减慢,但未影响食 物利用率,姜黄素表现为促进生长作用,所以高浓度姜 黄素作用下线虫体长依然增加,其具体作用机制还需 要更多的实验研究加以探讨。
各种组织和动物模型中,环界刺激及线粒体 等均可产生超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基等过氧化 因子,从而触发机体发生氧化反应〜1。随着机体内活
o
o o o o o 6 5
4
3
2
毒理学杂志2021 年2 月第35 卷第1期J Toxicol February 2021 Vol. 35 No. 1• 19 •
性氧(R O S)产生增多,体内抗氧化防御系统被激活,包 括抗氧化酶体系,如S O D、C A T、硫氧还蛋白、谷氧还蛋 白、谷胱甘肽过氧化物酶等,和非酶氧化物,如抗坏血 酸(维生素C)和a-生育酚(维生素E)等h5161。这些 抗氧化体系在机体内组成一条氧化屏障,共同维持着 机体的稳态。
姜黄是一种天然素和调味品,在中医药领域的 使用已经有近百年的历史,近年来姜黄素作为姜黄的最重要提取物被广泛研究,其抗氧化作用已经受到人们的广泛重视。本次研究选择姜黄素的安全剂量2.5 (xmol/L,观察到姜黄素可以减少线虫在氧化应激状态下产生的R0S,进一步对线虫体内的抗氧化屏障成分进行分析时发现,S O D和C A T的活性增强,提示 高浓度姜黄素引起线虫体内的抗氧化酶系统被激活,以抵御机体发生的氧化应激。由此可见,姜黄素在线 虫体内主要表现为抗氧化作用,能够有效清除线虫在 应激状态下产生的过量R O S,同时提高S O D和C A T 活性,以抵御机体的氧化损伤,维持机体稳态。
综上所述,24 h姜黄素急性暴露可对线虫生长发育、咽泵振动频率产生影响,当线虫处于氧化应激状态 时,不仅可以清除R0S自由基,还可以激活体内抗氧化酶,包括S0D、C A T以应对氧化损伤。该研究结果 提供了姜黄素的急性暴露的数据,为姜黄素的安全性 评价奠定基础,并证实姜黄素是一种天然的抗氧化物质,能够有效抵抗氧化损伤,为今后姜黄素的进一步开 发利用提供了有效的理论依据。
参考文献
[1] Kunnumakkara AB, Bordoloi D, Padmavathi G, et al.
Curcumin, the golden nutraceutical :multitargeting for
multiple chronic diseases[ J].Brit J Pharmacol, 2017, 174
(11):1325-1348.
[2] SSoleimani V,Sahebkar A, Hosseinzadeh H. Turmeric
(Curcuma longa) and its major constituent (curcum in) as
nontoxic and safe substances:Review [ J ]. Phytother R e s,
2018, 32(6):985-995.
[3] Andrew R,Izzo AA. Principles of pharmacological research
of nutraceuticals [ J].Brit J Pharmacol, 2017, 174( 11):
1177-1194.
[4] Harris TW. WormBase :a multi-species resource for
nematode biology and genomics [ J ]. Nucleic Acids R e s,
2004, 32(90001):411D-417D.
[5] Lai CH , Chou C Y, C h^n g L Y,et al. Identification of novel
human genes evolutionarily conserved in Caenorhabditis
elegans by comparative proteomics [ J ]. Genome R e s,
2000, 10(5):703-713.
[6] Kudron MM, Victorsen A, Gevirtzman L, et al. The
ModERN resource :genome-wide binding profiles for
hundreds of drosophila and caenorhabditis elegans
transcription factors [ J ]. Genetics, 2018, 208 ( 3 ) :937-
949.
[7] Qureshi S, Shah AH, Ageel AM. Toxicity studies on
Alpinia galanga and Curcuma longa [ J ].Planta M ed,
1992, 58(2):124-127.
[8] Vaughn AR, Branum A, Sivamani RK. Effects of turmeric
(Curcuma longa) on skin health:    A systematic review of
the clinical evidence [ J ]. Phytother Res, 2016, 30(8):
1243-1264.
[9] Chen Z, Cai J,Gao B, et al. Detecting the causality
influence of individual meteorological factors on local
PM2. 5 concentration in the Jing-Jin-Ji region[ J].Sci Rep-
Uk, 2017, 7(1):40735.
[10]Huang F, Lan K, Kang H , et al. Effect of curcumin on in
vitro early post-implantation stages of mouse embryo
development[ J]. Eur J Obstet Gyn R B, 2013, 166( 1):
47-51.
[11]K6dasi A,Maruniakov6 N,Stochmal’ov6 A,et al. Direct
effect of curcumin on porcine ovarian cell functions [ J ].
Anim Reprod Sci, 2017, 182:77-83.
[12]张文静,张楠,李国君,等.北方某燃煤区PM25对秀丽
隐杆线虫毒效应的初步研究[J].毒理学杂志,2019,33
(2):96-102.
[13]Chen C, Hsieh M, Hsuuw Y, et al. Hazardous effects of
curcumin on mouse embryonic development through    a
王晓晨
mitochondria-dependent apoptotic signaling pathway [J].Int
J Mol Sci, 2010, 11(8):2839-2855.
[14]李玉英,张东丹,李娇,等.连翘花黄素对秀丽隐杆线
虫在氧化应激下的保护作用[J].中国生物化学与分子
生物学报,2019, 35(4):436-445.
[15]Hanschmann E, Godoy JR, Berndt C , et al. Thioredoxins,
glutaredoxins,and peroxiredoxins—molecular mechanisms
and health significance :from cofactors to antioxidants to
redox signaling[ J ]. Antioxid Redox Sign, 2013, 19( 13):
1539-1605.
[16]Marengo B,Nitti M , Furfaro AL, et al. Redox homeostasis
and cellular antioxidant systems:crucial players in cancer
growth and therapy [ J ]. Oxid Med Cell Longev, 2016,
2016:6235641.
(收稿日期:2020-05-26)