STIP1correlates with tumor immune infiltration and prognosis as a potential immunotherapy target:a pan-cancer bioinformatics analysis
GUAN Shenyuan 1,SHEN Zhiyong 1,LIN Mingdao 1,DENG Haijun 1,FANG Yuan 21
Department of General Surgery,2Department of Radiation Oncology,Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China
用。方法使用生物信息学方法分析TCGA 、TARGET 和GTEx 数据库，研究STIP1在各种类型肿瘤组织中的表达及预后价值；采用免疫组化检测STIP1在10例配对结直肠癌组织以及正常组织中的表达情况；STIP1与肿瘤突变负荷（TMB ）、微卫星不稳定（MSI ）的关系进一步被揭示；使用MCPcounter 、TIM
ER 分析STIP1的表达与免疫细胞的浸润情况；分析STIP1与免疫调节因子的相关性；根据各肿瘤中STIP1的最优截断值，将样本分为高低表达组；使用蛋白互作网络分析鉴定与STIP1相关的蛋白；通过功能富集分析寻STIP1可能参与的调节通路。结果与正常组织相比，STIP1在大多数肿瘤中高表达（P <0.05），以及免疫组化的结果显示其在结直肠癌组织中高表达。STIP1的表达水平与多种类型肿瘤的临床分期相关（P <0.05）。在部分肿瘤中，STIP1的表达上调与肿瘤患者的不良预后（总体生存期、疾病特异性生存期、无病生存期和无进展生存期）显著相关（P <0.05）。STIP1表达与多种肿瘤的肿瘤突变负荷、微卫星不稳定、免疫浸润以及免疫调节相关因子显著相关（P <0.05）。蛋白互作网络分析提示STIP1相关的蛋白有热休克蛋白A 家族成员4、热休克蛋白A 家族成员8、热休克蛋白90α家族A 类成员1等。KEGG 富集分析提示在肝癌组织中STIP1高表达可能与戊酸盐代谢、氨酸代谢、丁酸盐代谢等通路有关；HALLMARK 富集分析提示在肝癌组织中STIP1高表达可能与胆汁酸代谢、脂肪酸代谢等有关。结论STIP1在多数肿瘤中表达上调，STIP1与部分肿瘤的临床分期、不良预后、肿瘤突变负荷、微卫星不稳定、免疫细胞浸润以及免疫调节因子相关。关键词：STIP1；压力诱导磷酸蛋白1；免疫调节因子；泛癌分析
Abstract:Objective To investigate the correlation of stress-inducible phosphoprotein 1(STIP1)expression level with prognosis of different cancers and its potential role in immunotherapy.Methods TCGA,TARGET and GTEx databases were used for bioinformatic analysis of
STIP1expression level and its prognostic value in different cancers.We also detected STIP1expression immunohistochemically in 10pairs of colorectal cancer and adjacent tissues.We further analyzed the correlation of STIP1expression level with tumor mutational burden,microsatellite instability,immune cell infiltration,immune regulators and outcomes of different cancers.STIP1-related proteins were identified using protein-protein interaction (PPI)network analysis,and functional enrichment analysis was performed to analyze the regulatory pathways involving STIP1.Results Bioinformatics analysis showed that STIP1was highly expressed in most tumors compared with the normal tissues (P <0.05),which was confirmed by immunohistochemistry of the 10pairs of colorectal cancer tissues.STIP1expression level was correlated with clinical stages of multiple cancers (P <0.05),and in some cancer types,an upregulated STIP1expression was correlated with a poor prognosis of the patients in terms of overall survival,disease-specific survival,disease-free survival and progression-free survival (P <0.05).STIP1expression was significantly correlated with tumor mutational burden,microsatellite instability,immune cell infiltration and immunomodulatory factors in most tumors (P <0.05).PPI network analysis indicated that STIP1-related proteins included HSPA4,HSPA8,and HSP90AA1.KEGG enrichment analysis suggested that the high expression of STIP1in liver cancer was related mainly with valerate metabolism,tryptophan metabolism,and butyrate metabolism pathways;HALLMARK enrichment analysis suggested high STIP1expression in liver cancer was involved in bile acid and fatty
acid metabolism.Conclusion STIP1is up-regulated in multiple cancer types and its expression level is correlated with clinical tumor stage,tumor mutational burden,microsatellite instability,immune cell infiltration and immunomodulatory factors.
Keywords:stress-inducible phosphoprotein 1;stress induced phosphoprotein 1;immune-related gene;pan-cancer analysis
目前癌症的手段主要包括手术、化疗、放疗、靶
向和免疫，但疗效不尽人意。因此，需要寻新的靶点用于肿瘤的诊断与［1］。免疫疗法是比较有前景的肿瘤手段，尤其是基于免疫检查点的免疫
疗法［2］
。肿瘤微环境由肿瘤细胞、宿主细胞以及周围基质构成，而免疫检查点与肿瘤微环境中的免疫细胞关系
收稿日期：2022-12-31
基金项目：国家自然科学基金（81972631）；广州市科技计划项目（202201010911）；南方医院院长基金（2020C033）
Supported by National Natural Science Foundation of China (81972631).作者简介：关深元，硕士研究生，E-mail:****************
通信作者：邓海军，博士，主任医师，E-mail:****************；方媛，博士，医师，E-mail:********************
J South Med Univ,2023,43(7):1179-1193doi 10.12122/j.issn.1673-4254.2023.07.15
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密切［3,4］。PD-1是一种阻止T 细胞免疫应答的免疫调节分子。肿瘤细胞可以通过过度表达PD-L1来抑制T 细胞的活性［5］。CTLA-4是T 细胞的共刺激分子，可以抑制T 细胞免疫应答。目前已有多种抗CTLA-4抗体用
于晚期黑素瘤和肺癌的［6］
。
压力诱导磷酸蛋白1（STIP1）亦称热休克蛋白70/90的组织蛋白，可作为共伴侣使得客户蛋白从热休克蛋
白70转移到热休克蛋白90伴侣系统［7,8］
。而STIP1除了作为组织蛋白外，还参与转录调节、细胞周期调节、信号转导、蛋白质折叠和细胞分裂等过程。既往研究表明，
在肝癌［9］、胰腺癌［10］、结直肠癌［11,12］、胃癌［13］以及卵巢癌［14］
等恶性肿瘤中，STIP1表达升高往往提示不良预后［9-14］。尽管已有文献报道STIP1与肿瘤的进展相关［7,10,11,13-17］，但绝大多数研究仅限于特定类型的恶性肿瘤。在宫颈癌中，STIP1可以通过Wnt/β-catenin 通路调节M2型丙酮酸激酶与乳酸脱氢酶表达，进而调控肿瘤细胞的生长［16］；在胰腺癌中，STIP1通过激活端粒酶逆转录酶与细胞周期蛋白Cyclin D1促进肿瘤恶性进展［10］；在卵巢癌中，STIP1通过激活ALK2-SMAD 信号通路，促使DNA 结合抑制因子3（ID3）转录激活，进而调节肿瘤的
进展［14］
；在肺腺癌中，STIP1通过激活JAK2/STAT3通路以及调节EMT 蛋白从而促进肿瘤［15］等。尽管如此，目前关于STIP1在泛癌中的内在联系尚未见报道。全面阐明STIP1在泛癌中的表达、预后价值及分
子特征，对寻潜在的肿瘤新靶点具有重要的临床意义。本研究使用大量的肿瘤数据库，分析探讨了STIP1在泛癌中的表达以及其与临床特征的关系。
1资料和方法1.1材料
1.1.1肠癌标本本研究中使用的人类结直肠组织样本于2013年1月1日~2017年1月31日从南方医院普通外科（中国广州）获得，并经南方医院研究所医学伦理委员会批准（NFEC-2022-300）。共10例配对的肿瘤组织与正常粘膜样本。
1.2数据集下载及数据处理
数据处理流程图所示。从UCSC （xenabrowser/）数据库中下载统一标准化的泛癌数据集：TCGA ，TARGET 和GTEx （正常组=19131例，肿瘤组=60499例），然后从中提取STIP1基因在各个样本中的表达数据，对每个表达值进行log2（x+0.001）变换，最后剔除单个癌种中样本个数小于3个的癌症，最终获得34种肿瘤的表达数据。其中多形成性胶质细胞瘤（GBM ，T=153，N=1151）、胶质瘤（GBMLGG ，T=662，N=1151）、脑低级别胶质瘤（LGG ，T=509，N=1151）、子宫内膜癌（UCEC ，T=180，N=23）、乳腺浸润癌（BRCA ，T=1092，N=292）、宫颈鳞癌和腺癌（CESC ，T=304，N=
13）、肺腺癌（LUAD ，T=513，N=396）、食管癌（ESCA ，T=
181，N=664）、胃和食管癌（STES ，T=595，N=873）、肾乳头状细胞癌（KIRP ，T=288，N=167）、混合肾癌（KIPAN ，T=884，N=167）、结肠癌（COAD ，T=288，N=345）、结直肠癌（COADREAD ，T=380，N=355）、前列腺癌（PRAD ，T=495，N=152）、胃癌（STAD ，T=414，N=209）、头颈鳞状细胞癌（HNSC,T=518，N=44）、肾透明细胞癌（KIRC ，T=530，N=167）、肺鳞癌（LUSC ，T=498，N=396）、肝细胞肝癌（LIHC ，T=369，N=160）、肾母细胞瘤（WT ，T=120，N=167）、黑素瘤（SKCM ，T=102，N=558）、膀胱尿路上皮癌（BLCA ，T=407，N=28）、甲状腺癌（THCA ，T=504，N=337）、直肠腺癌（READ ，T=92，N=10）、卵巢浆液性囊腺癌（OV ，T=418，N=88）、胰腺癌（PAAD ，T=178，N=169）、睾丸癌（TGCT ，T=148，N=165）、子宫肉瘤（UCS ，T=57，N=78）、白血病（ALL ，T=132，N=337）、急性髓细胞样白血病（LAML ，T=173，N=337）、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤（PCPG ，T=177，N=3）、肾上腺皮质癌（ACC ，T=77，N=127）、肾嫌细胞癌（KICH ，T=66，N=167）以及胆管癌（CHOL ，T=36，N=9）。使用R 语言（version 3.6.4）计算每个肿瘤中正常样本和肿瘤样本的表达差异，使用非配对的Wilcoxon Rank Sum and Signed Rank Tests 进行差异显著性分析。配对样品差异显著性分析使用配对t 检验（图1）。1.3免疫组化
从包埋好的组织块中切下连续切片，然后将切片进行脱蜡、水化，并在微波炉中用柠檬酸盐缓冲液（pH=6.0）煮沸10min 后提取抗原。再通过3%过氧化氢溶液孵育载玻片以阻止内源性过氧化物酶活性。
然后将切片与抗STIP1抗体（1∶100，Abcam ），随后将切片与山羊兔二抗孵育。最后切片用苏木精复染，脱水，封片。1.4多种类型癌组织生存结果的分析
从先前发表在Cell 上的TCGA 预后研究［18］中获得高质量的TCGA 的预后数据集，以及从UCSC 网站上获取TARGET 随访数据作为补充并剔除随访时间短于30d 的样本，对每个表达值进行log2（x +0.001）变换，最终获得了44种肿瘤。使用R 包maxstat 计算泛癌基因
表达谱中各肿瘤样本STIP1的最佳截断值［19］
，按照此截断值将各肿瘤样本分为高低表达组。使用R 软件包survival 的coxph 函数建立COX 比例风险回归模型，以分析基因表达与每个肿瘤中的预后关系，然后使用Logrank test 进行统计检验获得预后显著性。1.5肿瘤突变负荷与微卫星不稳定分析
从GDC （portal.v/）上下载经MuTect2软件［20］处理的所有TCGA 样本的Simple Nucleotide Variation 数据集，利用R 软件包maftools 的tmb 函数计算肿瘤的肿瘤突变负荷（TMB ），然后整合样本的肿瘤突变负荷和基因表达数据。从先前的研究
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中［21］获取的每个肿瘤的微卫星不稳定评分（MSI ），通过整合基因表达数据，进一步的对每个表达值进行log2（x+0.001）变换，最后剔除每种癌症中样本数小于3个的癌症，最终获得37种肿瘤的表达数据，使用Pearson 检验评估相关性。
1.6STIP1表达与肿瘤细胞浸润、免疫调节基因表达的相关性分析
使用R 软件包IOBR ［22］的MCPCounter 方法［23］以及Timer 方法［24］，根据基因表达重新评估不同癌症中每个患者的肿瘤细胞浸润评分，使用R 软件包psych （version 2.1.6）的st 函数计算各肿瘤中基因与免疫细胞浸润评分的相关性。从各肿瘤的表达谱中提取150个免疫调节相关基因［25］，包括5大类：趋化因子、趋化因子受体、MHC 基因、免疫抑制因子和免疫刺激因子，然后与STIP1进行Pearson 相关性分析。1.7蛋白互作网络与功能富集分析
通过使用STRING 网站（/）构建
STIP1的蛋白-蛋白互作网络［26］
。使用GSEA 软件，根据STIP1表达水平将TCGA 数据库中369例肝癌样本，分成高表达组（≥50%）和低表达组（<50%），通过京都基因与基因组数据库（KEGG ）以及HALLMARK 数据库进行富集分析。
1.8统计学方法
比较正常组织与肿瘤组织之间STIP1的表达差异采用Wilcoxon 检验。使用Kaplan-Meier 生存曲线评估STIP1高、低表达组的预后差异，统计分析基于log-rank 检验。计算STIP1表达与免疫细胞浸润相关性时采用Pearson 相关性分析。P <0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1泛癌中STIP1的表达水平
根据TCGA 、TARGET 和GTEx 数据库的结果，与
正常组织相比，STIP1在27种癌症组织中显著高表达，
其中包括多形成性胶质细胞瘤（GBM ）、胶质瘤（GBMLGG ）、脑低级别胶质瘤（LGG ）、子宫内膜癌（UCEC ）、乳腺浸润癌（BRCA ）、宫颈鳞癌和腺癌（CESC ）、肺腺癌（LUAD ）、食管癌（ESCA ）、胃和食管癌（STES ）、混合肾癌（KIPAN ）、结肠癌（COAD ）、结直肠癌（COADREAD ）、前列腺癌（PRAD ）、胃癌（STAD ）、头颈鳞状细胞癌（HNSC ）、肝细胞肝癌（LIHC ）、肾母细胞瘤（WT ）、黑素瘤（SKCM ）、膀胱尿路上皮癌（BLCA ）、直肠癌（READ ）、卵巢浆液性囊腺癌（OV ）、胰腺癌（PAAD ）、子宫肉瘤（UCS ）、白血病（ALL ）、急性髓细
胞样白血病（LAML ）、胆管癌（CHOL ）；而在肾透明细胞癌（KIRC ）、甲状腺癌（THCA ）、睾丸癌（TGCT ）中表达较正常组织显著下调（图2A ）。以及在TCGA 数据库可到的配对组织中，总计20种癌种，与正常组织相比较，STIP1的表达在5种肿瘤中没有表达差异，包括：肾嫌细胞癌（KICH ）、混合肾癌（KIPAN ）、肾透明细胞癌（KIRC ）、肾乳头状细胞癌（KIRP ）以及前列腺癌（PRAD ）；14种癌症组织中显著上调，其中包括膀胱尿路上皮癌（BLCA ）、乳腺浸润癌（BRCA ）、胆管癌（CHOL ）、结肠癌（COAD ）、结直肠癌（COADREAD ）、食管癌（ESCA ）、头颈鳞状细胞癌（HNSC ）、肝细胞肝癌（LIHC ）、肺腺癌（LUAD ）、肺鳞癌（LUSC ）、直肠癌（READ ）、胃癌（STAD ）、胃和食管癌（STES ）、子宫内膜癌（UCEC ），而甲状腺癌（THCA ）是表达下调的（图2B ）。免疫组化实验显示，STIP1在人结肠正常组织中低表达，而在结肠癌组织中高表达（图3）。
2.2泛癌中STIP1的表达与临床特征的关系
根据TCGA 数据库的结果显示，在BRCA 、KIRP 以及LUAD 中，STIP1随着分期升高表达上调；在LIHC 和UCS 中，STIP1的表达随着I 、II 、III 期的升高而上调，IV 期表达下降；在THCA 中，III 期较I 期STIP1的表达下调，与其肿瘤组织中低表达结果一致（图4）
。
图1流程图
Fig.1Flow chart of the study.
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2.3泛癌中STIP1的预后价值分析
44种肿瘤的COX 回归分析结果显示，STIP1的表达与15种肿瘤患者的总体生存期显著相关，如：GBMLGG 、LAML 、BRCA 、CESC 、LUAD 、KIRP 、HNSC 、LIHC 、SKCM 、神经母细胞瘤（NB ）、间皮瘤（MESO ）、葡萄膜黑素瘤（UVM ）、LAML 、肾上腺皮质
癌（ACC ）和肾嫌细胞癌（KICH ）（图5A ）。K-M 生存曲线表明，STIP1的表达上调与LAML 、BRCA 、KIRP 、LUAD 、HNSC 、LIHC 、MESO 和ACC 较差的总体生存期显著相关（图5B ）。分析STIP1的表达与38
种肿瘤的
图2STIP1在泛癌中的表达水平
Fig.2Pan-cancer analysis of STIP1expression.A :Expression levels of STIP1in 34cancer types from TCGA,TARGET and GTEx databases.B :Expression levels of STIP1in matched tumor and normal tissues.*P <0.05,**P <0.01,***P <0.001,****P <0.0001.
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COAD
Normal
Tumor
×10
×10
×40×40
图3STIP1在结肠癌中的表达水平
Fig.3Expression of STIP1in colorectal cancer tissues deteceted by immunohistochemistry (n =10).
图4STIP1表达水平与临床分期之间的相关性
Fig.4Association between STIP1expression and clinical tumor stage.*P <0.05,**P <0.01,***P <0.001.
Stage I Stage II Stage III Stage IV
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