徐陆亭;赵瑞景;董增军;朱铁年
【摘 要】最近研究显示，包括非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）在内的许多恶性肿瘤存在ROS1受体酪氨酸激酶基因重排。ROS1基因重排作为一种新发现的NSCLC亚型，其发生率约占NSCLC的1%-2%，优势人通常为年轻、不吸烟的肺腺癌患者，这些临床特征与ALK重排的NSCLC患者类似。体外实验和早期临床试验均显示，克唑替尼对ROS1重排阳性的癌症患者具有明显的抗肿瘤活性，第8周和第16周时疾病控制率分别为76%和60%，患者的总缓解率为56%。进一步了解ROS1基因重排在NSCLC发病中的作用，提高ROS1基因重排的检测技术，发现ROS1重排患者及研发特异性ROS1激酶抑制剂将为肿瘤个体化增添新的篇章。%Chromosomal rearrangements involving the ROS1 receptor tyrosine kinase gene have recently been described in multiple malignancies, including non-small cell lung cancer (NSCLC). ROS1 rearrangement defines a new molecular subset of NSCLC with the prevalence of ROS1 rearrangements around 1%-2%. ROS1-positive NSCLCs arise in young never-smokers with adenocarcinoma that are similar to those observed in patients wit
h ALK-rearranged NSCLC. Crizotinib demonstrates in vitro activity and early clinical trial shows marked antitumor activity in ROS1-rearranged patients. The overall response rate is around 56% and the disease control rate at 8 weeks is about 76%. Further understanding the ROS1 fusions in the pathogenesis of NSCLC, methods to detect ROS1 rearrangements, and targeting ROS1-rearranged NSCLC patients with specific kinase inhibitors would lead to an era of personalized medicine.
【期刊名称】《中国肺癌杂志》
【年(卷),期】2013(000)012
【总页数】8页(P663-670)
【关键词】ROS1受体酪氨酸激酶;间变性淋巴瘤激酶;肺肿瘤;克唑替尼;个体化
【作 者】徐陆亭;赵瑞景;董增军;朱铁年
【作者单位】200120上海，赛信通 上海 生物试剂有限公司;050017石家庄，河北医科大学
免疫学教研室;200120上海，赛信通 上海 生物试剂有限公司;050082石家庄，白求恩国际和平医院肿瘤科
【正文语种】中 文
在过去的十年里，针对肿瘤重要分子标志及信号传导途径癌症的靶向药物研究取得了重大进展。根据分子标志筛选特定的疾病人，应用阻断此标志的小分子化合物或单克隆抗体为肿瘤靶向提供了个体化模式的新思路，即发现新靶标，开发靶向新药物，筛选靶向药物患者。作为肺癌驱动基因之一的表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）酪氨酸激酶突变体的发现开启了非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）靶向之门[1]。对EGFR酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors, TKIs）的临床研究历程，从非选择患者到选择特定患者，从临床病理选择到分子标志物检测EGFR基因突变，而以EGFR-TKIs一线EGFR基因突变患者的成功，标志性的奠定和推动了肺癌个体化的进程[2,3]。近两年针对间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase, ALK）融合基因的NSCLC靶向的再次成功为肺癌驱动基因的研究锦上添花[4-6]，而越来越多的肺癌相关驱动基因的发现（如ROS1、RET、KRAS、HER2、B
RAF、PI3KCA、MEK1/2、MET等），终将为NSCLC个体化铺就蓝图[7]。本文对新发现ROS1融合基因靶点及针对这些靶点的检测方法以及药物进展做一综述。
1 ROS1结构和生物学特性
受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase, RTK）是多种生长因子、细胞因子和激素的高亲和力细胞表面受体和胞内受体偶联的酪氨酸蛋白激酶总和。EGFR属于I类RTK的EGFR/ErbB家族，而ALK属于X类RTK的LTK 家族，ROS 1则属于II类RTK的胰岛素受体家族。作为一个独特的受体酪氨酸激酶，ROS1在进化上相对保守。1982年，ROS1在UR2鸟肉瘤病毒中被确定为具有独特致癌作用的病毒原癌基因，此v-ROS1与gag基因发生融合而高表达具有致癌作用的蛋白质酪氨酸激酶融合蛋白p68gag-ROS[8,9]。哺乳动物原癌基因c-ROS1位于第6号染体q21区，全长cDNA包含44个外显子，编码2347个氨基酸，分子量为259 kDa。基本结构由胞外N-末端配体结合区（氨基酸1-1861）、跨膜区（氨基酸1862-1882）及胞内C-末端464个氨基酸构成的酪氨酸激酶活性区（氨基酸1883-2347）组成[10]。尽管ROS1为少数孤儿受体RTK，而缺乏对其配体的认知，但在蛋白质序列与结构分析上属于II类RTK胰岛素受体家族。最近的氨基酸序列分析显示，在酪氨酸激酶区ROS1与ALK有49%的同源性，因为A
LK酪氨酸激酶小分子抑制剂克唑替尼（crizotinib）的作用靶点在ALK激酶催化区的ATP结合位点，ROS1激酶催化区的ATP结合位点与ALK激酶催化区的ATP结合位点二者同源性高达77%[11]，因此ALK酪氨酸激酶小分子抑制剂克唑替尼（crizotinib）在ROS1发生融合变异的NSCLC中具有明显疗效[12-15]。
尽管ROS1受体酪氨酸激酶在人体正常组织的功能尚未明了，但ROS1异位表达以及ROS1激酶的变异活化见于诸多肿瘤，如多形性神经胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌以及肝外胆管癌，显示ROS1激酶活化诱导细胞的异常增殖与存活。在致病机理方面，尽管缺乏ROS1激活的合适配体或小分子激活剂，先前应用点突变和EGFR胞外受体部分构建的EGFR-ROS1嵌合蛋白表达技术业已证明，ROS1受体酪氨酸激酶参与激活多条下游信号转导通路，包括RASMAPK/ERK、PI3K/AKT/mTOR、JAK/STAT3以及PLCγ/IP3和SHP2/VAV3途径。前三者与肿瘤细胞增殖与存活有关，而后两者介导细胞形态转化和参与肿瘤细胞转移和迁移[11,16,17]。最近Gu等[18]在鼠白血病细胞系Ba/F3中高表达不同亚型的FIG-ROS1[fusion in glioblastoma (FIG)-ROS1]融合基因再次证明上述5种信号转导通路参与ROS1融合蛋白的致瘤作用。此外，ROS1激酶结合细胞骨架蛋白和细胞-细胞相互作用蛋白，直接或间接介导细胞骨架蛋白磷酸化，参与正常细胞的转化过程[19]。尽管类似其它RTK二聚化进而诱导其激
酶活性异常活化的模式在报道中只是推测，但是多项试验[20,21]证明活化诱导ROS1-RTK胞内激酶催化区酪氨酸自身磷酸化（Y2274和Y2334）在正常细胞转化至瘤作用中尤为重要。
2 ROS1融合基因
朱铁迄今为止，在非小细胞肺癌中已发现至少有9种不同的ROS1融合基因（图1），包括最早发现于神经胶质母细胞瘤中的FIG-ROS1以及CD74-ROS1、SLC34A2-ROS1、TPM3-ROS1、SDC4-ROS1、EZR-ROS1、LRIG3-ROS1、KDELR2-ROS1和CCDC6-ROS1[21-27]。1987年在多形性神经胶质母细胞瘤细胞株U118MG中首先发现了FIG-ROS1融合基因[28]。FIG-ROS1融合基因的形成源于胶质母细胞瘤第6号染体内FIG和ROS1基因间一段240 kb DNA片段缺失（6q21）导致FIG-ROS1基因融合并持续表达活化的ROS1 RTK激酶[22]。最近，美国Cell Signaling Technology公司的科学家应用自制的高敏感高特异兔单克隆抗体建立的免疫组织化学染技术结合已知融合伙伴序列的RT-PCR技术在NSCLC中国人中筛查ROS1融合基因时，除了检测到SLC34A2-ROS1和CD74-ROS1两种常见的融合基因外，还首次在NSCLC中发现了FIG-ROS1融合基因[25]。
早在2007年科学家们在应用酪氨酸激酶蛋白组学技术筛选肿瘤致癌基因时就发现了在NSCL
C中存在ROS1基因重排现象[5,23]。文中作者对41例NSCLC细胞株和150例中NSCLC患者的肿瘤样本进行了大规模的酪氨酸激酶筛选。结果除了发现ALK基因重排外，还发现1例NSCLC细胞株（HCC78）和1例患者的肿瘤样本中有ROS1基因重排；通过RT-PCR和DNA测序确定了两个独立的ROS1融合产物，即SLC34A2-ROS1和CD74-ROS1融合基因。在HCC78细胞系中，钠磷酸盐转运蛋白家族成员A2（SLC34A2）N-末端部分序列与ROS1部分跨膜区及全部胞内C-末端形成两种不同长度的SLC34A2-ROS1融合蛋白。尽管SLC34A2蛋白在人体组织中广泛表达，但SLC34A2在小鼠II型肺泡上皮的表达参与了肺泡表面活性剂的合成，而SLC34A2基因突变与肺泡微小结石症形成有关，从而推断SLC34A2-ROS1基因重排可能参与了NSCLC的发病机制[29]。此HCC78细胞系后来被广泛应用于ROS1融合基因的研究。在1例NSCLC患者样本中，CD74的外显子1-6与ROS1部分胞膜和/或胞内C-末端氨基酸序列（包括外显子32/34到44）也形成两种不同长度的CD74-ROS1融合蛋白（图1）。CD74-ROS1基因重排在ROS1基因重排中最为常见，约占30%。CD74具有巨噬细胞移动抑制因子（macrophage migration inhibition factor,MIF）受体功能，MIF-CD74相互作用参与非受体酪氨酸激酶介导的MAPK和Rho GTP酶活化，因而对巨噬细胞在宿主防御功能有调节作用[30,31]。CD74同时作为一个MHC II类分子相关蛋白，部分参与了MHC II类蛋白的形成
和运输。随后的体外和小动物体内转化实验证明SCL34A2-ROS1和CD74-ROS1具有致癌作用[18,32]，而且后者还通过E-Syt1介导癌细胞的浸润和转移[32]。此后近两年如火如荼寻肺癌驱动基因的研究[14,24,26,33]进一步发现了TPM3-ROS1、SDC4-ROS1、LRIG-ROS1、EZR-ROS1和KDELR2-ROS1融合基因，并且均被证明在实验动物体内有致癌作用。
由于存在SCL34A2-ROS1基因重排的HCC78细胞系与上述其它ROS1融合基因在人或鼠真核细胞转染体系相比对克唑替尼只有中度敏感[12-14]，因此认为ROS1融合伙伴对ROS1酪氨酸激酶活性的影响因其亚细胞定位的差异可能反映出ROS1基因重组阳性肿瘤的临床病理表现和自然形成能力的潜在差异。比如，FIG-ROS1（S）和FIG-ROS1（L）之间的激酶活性和转化作用的差异归因于其在亚细胞的定位差异[18]。
与EML4-ALK基因重排产生的EML4-ALK融合蛋白定位于细胞质不同，不同的ROS1融合蛋白在细胞中的定位包括弥漫性胞浆分布、核周聚集、胞内微泡以及跨膜分布。SCL34A2-ROS1和CD74-ROS1为跨膜蛋白，而FIGROS1定位于细胞质或高尔基体。但是这些融合伙伴对NSCLC的致病作用还有待今后证明[11,18,23]。最后，值得注意的是上述不同类型的ROS1
基因重排而非ROS1自身突变参与了NSCLC的致病作用，因为在NSCLC中没有发现任何ROS1激酶结构域有突变产生。相反，在结肠癌、卵巢癌、乳腺癌以及NSCLC非腺癌亚型中出现低频率的ROS1基因突变，但这些突变的意义尚且未知[11,23]。
3 ROS1融合基因在NSCLC中的临床特征
图 1 非小细胞肺癌中ROS1基因重排类型。外显子E32、E34和E35为ROS1融合基因断裂部位。TM为ROS1跨膜部分。Fig 1 Type of ROS1 rearrangement in nonsmall cell lung cancer. Exons 32, 34 and 35 are the ROS1 fusion gene splicing domain.TM is transmembrane domain of ROS1.
ROS1基因重排与ALK基因重排在NSCLC中于2007年被同时发现[23]。由于ALK/MET多靶点RTK小分子抑制剂克唑替尼的成功研发，2008年全球首个ALK基因重排临床试验在美国开始筛选和招募NSCLC的ALK基因重排患者[4,34]。尽管在NSCLC中只有3%-7% ALK基因重排，但临床的巨大成功，使得ALK激酶抑制剂克唑替尼快速获得FDA批准用于EGFR无突变、ALK重排阳性的NSCLC的个体化[6]。相反由于没有相应的ROS1激酶小分子抑制剂，针对ROS1基因重排的NSCLC临床仅在最近相继报道[12-15]。这得益于体
外实验证明克唑替尼能够有效抑制含有SLC34A2-ROS1基因重排而无任何ALK重排变异的NSCLC细胞系HCC78的生长及诱导其凋亡[35]。
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