中国兽医科学2021,51(02〉： 161-168
Chinese Veterinary Science网络首发时间：2020-12-ll D01：10.16656/j.issn.l673-4696.2021.0024 中图分类号：S852.734 文献标志码：A文章编号：1673_4696(2021)02-016卜08猪带纟条虫丝氨酸蛋白酶抑制剂Ts-serpin-1对 人巨噬细胞THP-1的免疫调节功能研究
毕研丽\刘仲蓉'郭爱疆\张少华、王帅”，才学鹏
(1.中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室，甘肃兰州730046;
2.甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州730070;
3.中国兽医药品监察所，北京100081)
摘要：主要研究猪带绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂Ts-serpin-l(WormBase:TsM_000065700)对宿主THP-1 细胞的免疫调节作用通过设计特异性引物和RT-PCR扩增技术，获得Ts-serpin-1编码序列，用qRT-PCR 分析Ts-serpin-l基因在猜带線虫成虫和中綠期幼虫的表达情况；构建pCold-Ts-serpin-1原核表达栽体，诱导表达纯化重组蛋白Ts-serpin-1；用重组蛋白Ts-serpin-1处理THP-1细胞，采用qRT-PCR和ELISA方法检测Ts-serpin-1处理THP-1细胞后，各炎性细胞因子的变化情况，结果显示：获得的Ts-serpin-1目的基因长度为1149匕口，编码382个氨基酸，含有56卬丨11家族特有的反应中心环。7^-36叩丨11-1基因在猪
带绦虫 成虫和中绦期幼虫均表达，且成虫表达量显著高于幼虫。重组蛋白Ts-serpin-1的分子质量约为43 ku，可抑 制THP-1细胞促炎性细胞因子IL-6、IL-10、IL- 12、TNF-a、丨FN-y和iNOS2的表达，促进抗炎性细胞因子 1L-10和TGF-y3的分泌表达。以上结果提示，Ts-se卬in-1在寄生虫-宿主互作过程中可能发挥重要作用。
关键词：猪带绦虫；丝氨酸蛋白酶抑制剂；细胞因子；免疫调节
Study on immunomodulatory function of Taenia solium serine protease
inhibitor Ts-serpin-1 in THP-1 cells
BI Yan-li',LIU Zhong-liL2,GUO Ai-jiang1,ZHANG Shao-hua1,WANG Sliuai1* ,CAI Xue-peng1
(1. Stale Ke y Laboratory of Veterinary Etiological Biology/Lanzhou Veterinary Research Institute,Chinese A caclemy of
Agricultural Sciences ,Lanzhou730046, 2. College of Veterinary Medicine ,Gansu Agricultural University,Lanzhou
730070, C/h V ia；3.China Institute of Veterinary Drug Control,Beijing100081 ,China) Abstract：A seri
ne protease inhibitor Ts-serpin-1 (WormBase：TSM000065700) of Taenia solium was investigated for the immunomodulatory effects on THP-1 cells. The coding DNA sequence (CDS) of Ts~ser~ pin-1 was amplified by RT-PCR with specific primers. qRT-PCR was used to analyze the expression of Ts-serpin-1 gene in adult and larval stages. The recombinant protein Ts-serpin-1 was expressed and purified based on prokaryotic expression vector pCold I .After treatment with recombinant protein Ts~ser~ pin-1,the changes of cytokines in THP-1 cells were detected by qRT-PCR and ELISA. The sequence analysis showed that Ts-serpin-1 CDS was 1 149 bp in length,encoding a protein with 382 amino acids,which contains a specific reactive centre loop motif. The results of qRT-PCR revealed that expression of Ts-serpin-1 significantly higher in adult stage than that in larval stage. The recombinant protein Tsser-
收稿日期：2020-08-24；修回日期：2020-11 -27
基金项目：国家自然科学基金项目（31802179,31772726)；国家重点研发计划项目（2017YFD0501303)
作者简介：毕研丽（1981-)，女，山东莱芜人，博士生，研究方向为动物疫苗与分子免疫学，E-mail :biyanl ***********。*通 信作者：才学鹏（1958-)，男，黑龙江鸡西人，研究员，主要从事动物疫苗与分子免疫学研究，E-mail :CaiXp@vip.
163. com；王帅（1987-)，男，山东临沂人，特聘研究员，主要从事肠道寄生虫学和肠道免疫学研究{-〇^丨1^3叩-
*************,.
162中国兽医科学第51卷
pin-1 was expressed as a fusion with a molecular weight of 43 ku. The recombinant protein Ts-serpin-1 decreased the expression of pro-inflammatory cytokines IL-6,IL-l)S,IL-12,TNF-a,IFN-y and iN0S2 in the THP~1 cells that were stimulated by the recombinant protein and LPS and promoted the secretion and expression of anti-inflammatory cytokines IL~10 and TGF-/3 in THP~1 cells stimulated by IL-4. These results suggest that Ts-serpin-1 may play an important role in parasite-host interactions.
Key words：Taenia solium；serine protease inhibitor ；cytokines ；immune regulation
* Corresponding authors：CAI Xue-peng,E~mai 1：*************；WANG Shuai,E-mail ：wangshuai@ caas
猪带綠虫病（taeniasissolium)/囊尾蝴病（cys- ticercosis cellulosae)是由猪带绦虫（Taen/a soW um)及其中绦期幼虫猪囊尾蝴（Cyst/cercus ce//u/osae)引起的一种严重危害人类健康和养猪业发展的食源 性
寄生虫病I。猪带绦虫属于扁形动物门绦虫纲带 科带属，人既是其唯一的终末宿主，也可是其中间宿 主，严重威胁公共卫生安全>3:。世界卫生组织认为 囊尾蚴病是一种可根除的疾病，但目前时有发生，且 呈全球分布，主要流行于发展中国家，尤其是在非 洲、南美洲以及亚洲的部分国家和地区:4:。有报告显 示，全世界每年约有5万人死于脑囊尾蚴病仅在秘鲁约有18.8%的猪囊尾蝴感染者为脑囊尾蚴 病患者;8]。我国西南偏远、医疗卫生水平不高且有食 生猪肉习惯的地区，仍是猪带绦虫病和猪囊尾蚴病 局部高流行地区:9:。据报道，2014—2017年仅云南 省大理州寄生虫病防治中心就确诊囊尾蚴病病例 549 例_。
丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine protease inhibitors, Serpins)是一种结构相对保守的蛋白酶抑制剂超家 族，广泛存在于动物、植物、微生物中，具有保守的氨 基酸序列和相似的空间结构，功能高度分化1112]。寄 生虫的Serpins能够抑制丝氨酸蛋白酶及半胱氨酸 蛋白酶的活性，参与宿主凝血、炎症反应、细胞迁移、人侵宿主和细胞程序性死亡等生理过程％15。研究 表明，在蠕虫、原生动物和其他寄生虫中发现的大多 数Serpins在感染宿主的过程中发挥着至关重要的 作用[1M7]。本研究克隆表达了猪带绦虫丝氨酸蛋白 酶抑制剂家族成员Ts-serpin-1，初步分析了其生物 学功能，为深人研究Ts-serpin-1参与寄生虫人侵及 免疫逃避机制奠定了基础。
1材料与方法
1.1虫种、细胞和质粒
猪带绦虫成虫、猪囊尾蚴及原核表达载体pCold I 质粒均由中国农业科学院兰州兽医研究所蠕虫课题 组提供。人髓系白血病单核细胞(THP-1细胞）购自CCTCC细胞库。
1.2主要试剂
限制性核酸内切酶、OneStep RT-PCR试剂盒、pMD18~T simple vectorx TransScript II Green One- Step qRT-PCR SuperMix试剂盒和蛋白分子质量标 准等购自宝生物工程（大连）有限公司。TRlzol试剂 购自Invitrogen公司。人细胞因子ELISA检测试剂 盒、CCK-8试剂盒、总一氧化氮（NO)检测试剂盒、LPS、PMA和丨L-4均购自上海碧云天生物科技有限 公司。胎牛血清、RPMI 1640细胞培养基。细胞培养 瓶和细胞培养板均购自美国Gibco公司。大肠杆菌 DH5a和BL21(DE3)感受态细胞、4X蛋白上样缓冲 液均购自北京全式金生物技术有限公司。N i Sepharose6 Fast Flow蛋白纯化试剂盒购自美国GE 公司。
1.3 Ts-serpin-l基因的克隆和序列分析
从蠕虫组数据库中搜索Serpins同源基因 (WormBase:TsM_000065700)，利用Primer Premier 6.0软件设计其特异性引物：7V serp in-h F:5^C G- CQG—A—T^ATGTTTGCCAAGGAT-S，，下戈ij线处为 BamH I 酶切位点；TVse卬in-卜R: 5' -AC CAAGCT- ICTACTTGCTTTCCGGTTC-3,，下戈丨J线处为H/ndlll 酶切位点。提取猪带绦虫总RNA后，反转录合成cDNA 第一链，用特异性引物进行RT-PCR扩增。扩增条 件：94 T：5 min;94 X：50 s，58 °C45 s，72 X：60 s，34 个循环；72 °C10 min。用核酸
电泳验证扩增产物后，构建重组质粒pMD 18- Ts-serpin-1，连接产物转化 至感受态细胞D H5a，菌液PC R和双酶切筛选阳性 菌株后送西安擎科泽西生物科技有限责任公司测 序。利用在线软件SMART( b卜hei- delberg. d e/)预测测序正确的序列结构域；通过在线 软件 SWISS-MODEL(/) 预测T s-serp in-l基因的3D结构。
1.4 重组表达载体pCold-Ts-serpin-l的构建与表达纯化
重组质粒 pMD18-Ts-serpin_l 和pCold I 空载
第2期毕研丽等：渚带绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂Ts-serpin-1对人丨3噬细胞T H P-丨的免疫调节功能研究163
体分别经限制性内切酶BamH I和rt_n dIII双酶切，纯化回收酶切目的片段，16 °C连接过夜后转化感受 态细胞BL21(DE3)。将测序鉴定正确的重组质粒 pCold-Ts-serpin-1阳性克隆菌液接种于LB培养液 (含氨苄青霉素，100 M g/mL)中，加人终浓度为0.4 mmol/L的IPTG在16 °C条件下低温诱导8 h，以pCold I空载体做对照。4。。12 000Xg■离心收集菌 体，将菌体重悬于20 mLPBS中，反复冻融3次后，冰上超声破碎至菌液澄清。4°C 12 000X g离心，收 集上清和沉淀进行SDS-PAGE，分析蛋白表达情况。将离心后的上清液进行亲和层析纯化，测定表达的 重组蛋白Ts-serpin-1的浓度。
1.5 Ts-serpin-1在猪带绦虫不同发育阶段表达水平的分析
qRT-PCR引物序列如下：0八卩0!~1+:5'-0〇(：- ATCAATACCACCATC-3,,GAPDH-RjS^GGAAG- GACCATCAACAAC-3,；Ts-serpin-l-F^^TGGC- GGACTTCGTGGACCTG-3,,T^serpin-l-R：S^TC- TCGGCAACCTCAGTATCACCTC-3，。qRT-PCR反应体系为20 pL，反应程序如下:50 °C反转录5 min;
95 °C预变性 30 s;95 °C变性 5 s，60 °C退火 34 s，40 个循环。用方法对Ts-serpin-1基因在猪带绦 虫成虫期和中绦期幼虫中的转录水平进行相对定量 分析。
1.6 THP_1细胞增殖能力的CCK8法检测
将THP-1细胞悬液稀释至1X1〇5mL1，按照 100 孔将细胞接种于96孔细胞板。当细胞密度达80%时，分别加人终质量浓度为1、5、10、15 Mg/mL 的重组蛋白7Vserpin-l处理细胞。以LPS(100 ng/mL)处理细胞组及等体积的PBS处理细胞组分 别作为阳性和阴性对照，每组设3个重复。将处理 后的细胞置于C02细胞培养箱培养24 h后，每孔加 入10 PLCCK-8溶液，避光孵育2h。将96孔板放 置于酶标仪上，检测其的吸光度值(D45〇值），用Graph- Pad Prism6.0软件分析数据。
1.7总N O的检测
用重组蛋白7V serpin-l(质量浓度分別为1、2 和 5 M g/mL)和 LPS(100 ng/mL)共同刺激 THP-1 细胞，对照组为LPS(100 ng/mL)处理组和等体积的 PBS处理组。（：02细胞培养箱培养24h后收集上 清，用总N
O检测试剂盒测定THP-1细胞总N◦的 生成量，每个样品设置3个复孔。37 °C孵育1h。用酶标仪测定各孔吸光度（DM。值），用GraphPad Prism 6.0软件对所测数据进行统计分析。1.8免疫相关分子mRNA转录情况的qRT-PCR 检测
THP-1细胞经LPS处理可以诱导单核巨噻细 胞发生M l型极化,Th2型细胞因子IL-4可以诱导 发生M2型细胞转换18:。在6孔细胞培养板中，每孔 接种1X106个THP-1细胞，用PMA刺激贴壁后，分为实验组和对照组（见表1)。
表1不同处理组
Table 1Different treatment groups
组别Groups不同处理Different treatment
实验组
Ts-serpin-1 (5 ^g/mL) +L P S(100ng/mL) Experimental Ts-serpin-1 (5 ^g/mL) +IL-4 (10 ng/mL)
groups
Ts-serpin-1 (5 /ig/mL)
IL-4 (10 ng/mL)
对照组
Control groups
LPS (100 ng/mL)
PBS
将不同处理组的THP_1细胞在C02培养箱中 培养24 h后，分别提取6孔板中不同处理组细胞的 RNA，以1MgRNA为模板反转录合成cDNA，进行 qRT-PCR扩增分析，每个基因设3个重复孔。以/S-actin作为内参基因，免疫相关因子检测引物购自 广州复能基因有限公司。qRT-PCR反应完成后，用2^方法计算各基因的相对表达量。
1.9重组蛋白Ts-serpin-1对细胞因子表达水平的影响
为了进一步验证qRT-PCR检测结果，分别收集 上述6孔培养板处理组的THP-1细胞培养上清液，3 500 r/min离心 5 min吸上清，按照人 IL_6、TNF-a、IL-10和丨NF-y的ELISA试剂盒要求稀释各溶液及 标准品，检测各细胞因子的表达情况。用酶标仪测 定各孔吸光度（D«值），对所测数据进行统计分析。2结果
2.1 Ts-serpin-1基因的克隆及分子特征分析
测序结果表明，Ts-serpin-1的开放阅读框长为 1149bp(见图1A)，编码382个氨基酸。利用SWISS- MODEL(pasy_org/)，参照 5cdz.l.A 同源建模，对Ts-serpin-1进行蛋白结构预测，发现 其符合Serpins家族的结构特征，含有10个a螺旋，13个折叠，其余大多为无规卷曲，具有保守的活性 结构位点反应中心环(RCL)(见图1B)。诱导表达的 重组蛋白Ts-serpin-1的分子质量约为43 ku，纯化 后的蛋白的质量浓度为1.1 mg/mL，表明重组蛋白 TVserpin-1能够高效融合表达（见图1C )。
164中国兽医科学第51卷
图2 Ts-serpin-1在不同发育时期的相对表达水平
Figure 2 The relative quantification of Ts-serpin-1 at different development stages
1：囊尾蚴时期；2：成虫期**表示差异极显著（PC0.01)。
1：Larvae stage；2：Adult stage. ** indicates extremely significant difference (P<0.01).
2.3重组蛋白Ts-serpin-丨对T H P-l细胞增殖的影响
重组蛋白Ts-serpin-1对T H P-l细胞增殖影响
1 2 3 4 5 6
组別Group
图3重组蛋白T s-serp in-l对T H P-l细胞活力的影响Figure 3 Effect of Ts-serpin-1 on the viability of T H P-l cells
1 ：Control (PBS) ；2：LPS (100 ng/mL) ；3： Ts-serpin-1 (1 fxg/m L)；
4 ： Ts-serpin-1 (
5 /^g/mL) ；5： Ts-serpin 1 (10 /ig/m L) ；6： Ts-serpin-1 (15 Mg/mL).
*表示差异显著（P<0.05);n s表示无显著性差异下图同
* indicates significant difference (P<0.05) ；ns indicates no significant difference. The same as follows.
2.4 重组蛋白Ts-serpin-1对THP-1细胞N O生成的影响
与PBS空白对照组相比，用LPS处理TH P-l细
2 000 bp
1000 bp 750 bp 500 bp
250 bp 100 bp B
/JR C L n,。一
a-helix
图1Ts_serpin-1基因的扩增和分子特征预测及重组蛋白的纯化
Figure 1Amplification and prediction of the 3D structure of Ts-serpin-1 gene and purification of recombinant protein
A: Ts-serpin-1的PCR #■增（M:DNA 分子质量标准；1: Ts-serpin-1基因的PCR 扩增产物）；B: Ts-serpin-13D 结构的预测（a螺旋：a-he]ix 折 叠：月-sheet；反应中心环：R C L);C：纯化的重组蛋白Ts-serpin-l的分析（M：蛋■白质分子质量标准；1：重组蛋白Ts-serpin-1)
A ： PCR amplification of Ts-serpin-1 (M： DL2000 DNA Marker ； 1： PCR-amplified Ts-serpin- 1gene) ；
B ： Prediction of the 3D structure of Ts-serpin-1 (RCL：Reactive centre loop) ；C： Analysis ofthe purified T s-serpin-l recombinant protein (M： Protein molecular weight M arker； 1： Ts-serpin-1 recombinant protein).
2.2 Ts-serpin-1基因在成虫期表达水平显著高于囊尾蚴
qRT-PCR结果显示，Ts-serpin-1基因在猪带 绦虫/囊尾蚴均能表达，且绦虫成虫期表达量显著高 于中绦期幼虫（P<0.01)(见图2)。推测Ts-serpin-1 在猪带绦虫成虫期发挥重要作用。
15.的检测结果显示：与对照组相比，重组蛋白Ts-ser- pin_l的质量浓度低于5 pg/mL时不能影响THP-1 细胞增殖；但在高浓度重组蛋白的作用下（10和15 Pg/mL)明显影响THP-1细胞活力，且差异显著(P< 0.05)(见图3)。因此，后续实验中选择5 pg/m L的重 组蛋白Ts-serpin-1处理THP-1细胞。
2.0.
(u'
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u .2 s s a j d x l. a; > |«
组別Group
图4
Ts-serpin-1对T H P -1细胞N O 产生的影响
Figure 4 Effects of Ts-serpin-1 on NO production in THP-
1 cells
1：Control (PBS)；2：LPS (100 ng/m L)；3： 7s-serpin-l (1 ^g/m L ) + LPS (100 ng/m L );4:T s—serpin-1 (2 /ig/m L )+L P S (100 ng/m L); 5： Ts-serpin-1 (5 Mg/mL) + LPS (100 ng/mL).
2.5重组蛋白Ts -serpin-l 对炎性细胞因子mRNA
转录的影响张少华
qRT -PCR 结果显示，用重组蛋白TVserpin -1 与LPS 共同处理THP -1细胞24 h ，明显抑制促炎 性细胞因子TNF -a 、[L -6、丨L -旧和丨FN -7的mRNA 的表达水平，其中IL _l /8(见图5D )表达差异极显著 (P C 0.01)。对诱导型一氧化氮合酶2(iNOS 2)的检 测结果表明：经过重组蛋白Ts -serpin -1和LPS 共 同作用24h ，对iNOS 2(见图5H )抑制表达差异极显 著（P <0.01)。1L -4处理组与对照组相比，上调了抗 炎性细胞因子TGF -^见图5F )和IL -10(见图5G ) 的表达，重组蛋白TVserpin -1处理24 h 后的THP -1 细胞刺激抗炎性细胞因子丨L -10(见图5G )的表达， 表达水平差异极显著(P <0.01 )。
2.6重组蛋白Ts -serpin -1对细胞因子表达的影响
细胞因子检测结果显示，与LPS 对照组相比，
重组蛋白Ts -serpin -1可以不同程度地抑制促炎性 细胞因子TNF -a (见图6A )、IL -6(见图6B )和INF -7 (见阁6C )的分泌。与IL -4处理组相比，Ts -serpin -1 上调了抗炎性细胞因子IL -10(见图6D )的表达水 平（P < 0.05)。ELISA 检测结果与qRT -PCR 检测炎 症细胞因子mRNA 转录水平结果基本一致。
胞后刺激了 N O 的产生。本实验选用1、2、5 pg/mL 的重组蛋白7V se rp in -l 与LPS 共处理THP -1细胞 后检测对NO 产生的影响。结果(见图4)显示，5 pg/mL 重组蛋白Ts -serpin -1与LPS 共同处理THP -1细 胞后，显著抑制了 LPS 激活的THP -1细胞产生NO (P <0.05)o
80^
3讨论
Serpins 超家族是一类功能多样的球状蛋闩酶 抑制剂，核心结构含有8〜9个《螺旋、3个/S 折叠19 , 保守区域RCL 由20个氨基酸组成，能与相应靶蛋 白的活性位点结合，发挥生物学功能寄生性螺 虫的Serpins 与哺乳动物具有同源性，具有哺乳动物
Serpins 相似的生物学功能m 。寄生性蠕虫的Serpins 基因在线虫、吸虫、绦虫上均已被发现，且研究证实 多数可分泌到虫体外，易被宿主的免疫分子识别，从而
引起宿主产生免疫应答％。本实验中利用RT -PCR 从 猪带绦虫成虫中成功扩增到Ts -serpin -1基因，生物
Q 息学分析表明7Vserpin _l 具有Serpins 超家族成 员保守的活性位点反应中心环。利用SWISS-MODEL 预测其3D 结构发现，Ts -serpin -1有9个a 螺旋、13 个y S 折叠，符合Serpins 家族的特有的保守结构特征
Ts -serpin -1与人的Serpin B 3具有相似的结构，推 测其可能对宿主自身免疫调节发挥作用^5]。qRT -
PCK 结果显示，Ts -serpin -1主要在猪带绦虫成虫期 表达，从而使其成功在宿主体内寄生
N O 作为一种细胞毒性效应分子，是宿主抗寄 生虫炎症反应的重要防御介质，既可以直接杀伤人 侵感染的虫体，促进宿主肠道的排虫反应，又可以通 过间接作用破坏宿主正常的组织细胞，从而在寄生 虫病和其他多种疾病中发挥重要作用|27)。N O 的产 生释放受到效应分子iNOS 的调控，iNOS 的表达水 平间接地反映N ◦的释放水平i 28i 本实验中，用重组 蛋白7Vserpin -1和LPS 共同处理THP -1细胞24 h 后，qRT -PCR 检测发现iNOS 2 mRNA 表达水平降 低，Geriss 法检测发现细胞上清中N O 含量明显降
低，这一结果表明，Ts -serpin -1可能通过下调iNOS 的转录来抑制N O 的产生，调控衍主肠道以及局部 环境的免疫反应，从而有助于猪带绦虫在宿主体内 的寄生。
寄生性蠕虫在寄生过程中一般通过调节宿主的 免疫反应来逃避宿主的清除，通过分泌细胞闪子及 其介导的信号转导途径，抑制宿主炎症反应，形成有 利于蠕虫生存的抗炎环境夂30。从qRT -PCR 检测结 果发现，与LPS 单独处理组相比，用重组蛋白Ts -
serpin -1 处理 THP -1 细 胞后均抑制了 LPS 刺激的
TNF -a 、丨L -12、IL -6、IL -1)3和 IFN -y 分泌，表明 Ts - serpin -1 可能是一种潜 在的抑 炎活性 因子， 能够调 节宿主的炎症反应。用丨L -4处理THP -1细胞后，调 节宿主R 噬细胞极化，刺激其分泌大M 的抗炎性细 胞W 子丨L -10和TGF -y S 来调节宿主的免疫应答31
第2期 毕研丽等：猪带绦虫丝氨酸蛋11酶抑制剂Ts-serpm-丨吋人丨|噬细胞T H P -丨的免疫调V /功能研究 165
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