(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201880089039.1
(22)申请日 2018.12.21
(30)优先权数据
1721615.1 2017.12.21 GB
(85)PCT国际申请进入国家阶段日
2020.08.10
(86)PCT国际申请的申请数据
PCT/EP2018/086716 2018.12.21
(87)PCT国际申请的公布数据
WO2019/122388 EN 2019.06.27
(71)申请人 荷兰皇家科学院
地址 荷兰乌得勒支
申请人 斯蒂金胡布勒支有机物技术公司
(72)发明人 凯·克里施玛尔
约坦·埃拉扎尔·巴-艾普生
约翰尼斯·卡洛斯·克莱维尔斯 西尔维娅·费南德斯-波吉 罗伯特·格哈达斯·雅各布·弗里斯 (74)专利代理机构 北京英赛嘉华知识产权代理有限责任公司 11204代理人 王达佐 洪欣(51)Int.Cl.G01N 33/50(2006.01)C12N 5/09(2006.01) (54)发明名称
(57)摘要
本发明提供了类器官和免疫细胞的共培养
物，以及使用这些共培养物来鉴定用于疾病
的试剂的方法。权利要求书7页 说明书31页 附图20页CN 111989569 A 2020.11.24
C N 111989569
A
1.用于鉴定适合于癌症的试剂的方法，其中所述方法包括：
使类肿瘤共培养物与一种或多种候选试剂接触，其中所述类肿瘤共培养物包含免疫细胞和至少一种类肿瘤，
检测类肿瘤共培养物中是否存在指示候选试剂适合于所述癌症的一种或多种变化，和
如果检测到所述类肿瘤共培养物中一种或多种所述变化的存在或不存在，则将候选试剂鉴定为适合于所述癌症。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述癌症的适宜性包括所述癌症的功效和/或所述癌症的安全性。
3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种变化是一种或多种癌症生物标志物的变化。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种变化选自：细胞存活力的降低、细胞增殖的减少、细胞死亡的增加、细胞或类器官大小的变化、细胞运动性的变化、共培养免疫细胞的细胞因子和细胞毒性分子的产生的变化、完整/致密上皮细胞层的解离或破坏和一种或多种基因表达的变化。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述检测包括细胞增殖测定、存活力测定、流式细胞术分析、IFN-γ的ELISA、基因表达分析和/或细胞成像。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种变化是细胞存活力的降低，例如如通过CellTiter Glo发光细胞存活力测定试剂盒(Promega)、活性半胱天冬酶3的细胞内流式细胞术染(BD)或死亡细胞的阳性染检测的。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种变化是细胞死亡的增加，例如如通过明场成像检测的。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述方法之前是以下步骤中的一个或多个：
通过在类肿瘤培养基中培养肿瘤上皮细胞来制备所述至少一种类肿瘤；
从不纯的免疫样品中分离免疫细胞并在免疫细胞扩增培养基中培养所述免疫细胞，来制备所述免疫细胞；和/或
制备所述类肿瘤共培养物，优选地通过从至少一种类肿瘤中去除类肿瘤培养基，并使所述至少一种类肿瘤与所述免疫细胞在类肿瘤共培养培养基中混合来制备所述类肿瘤共培养物。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括将所述类肿瘤共培养物的所述一种或多种变化的存在或不存在与参考类器官或参考类肿瘤进行比较，并且其中所述方法还包括：
使参考类器官共培养物或参考类肿瘤共培养物与所述一种或多种候选试剂接触，其中所述参考类器官共培养物或所述参考类肿瘤共培养物包含免疫细胞和至少一种类器官或类肿瘤，和
检测所述参考类器官共培养物或所述参考类肿瘤共培养物中是否存在指示候选试剂适合于所述癌症的一种或多种变化。
10.如权利要求9所述的方法，其中如果在所述类肿瘤共培养物中检测到变化的存在或
不存在，而在所述参考类器官共培养物或所述参考类肿瘤共培养物中未检测到变化的存在或不存在，则候选试剂被鉴定为合适的试剂。
11.如权利要求9-10中任一项所述的方法，其中在所述方法之前是以下步骤中的一个或多个：
通过在类器官培养基中培养正常上皮细胞来制备所述至少一种类器官；
从不纯的免疫样品中分离免疫细胞并在免疫细胞扩增培养基中培养所述免疫细胞，来制备所述免疫细胞；和/或
制备所述参考类器官共培养物或所述参考类肿瘤共培养物，优选地通过从至少一种类肿瘤或至少一种类器官中去除所述类肿瘤培养基类器官培养基，随后将至少一种参考类器官或至少一种参考类器官与所述
免疫细胞在类器官共培养培养基或类肿瘤共培养培养基中混合来制备所述参考类器官共培养物或所述参考类肿瘤共培养物，
任选地，其中所述不纯的免疫样品是肿瘤样品、正常结肠组织和/或外周血。
12.如权利要求8-11中任一项所述的方法，其中所述正常上皮细胞与所述肿瘤上皮细胞是自体同源的。
13.如权利要求9-12中任一项所述的方法，其中所述参考类器官共培养物或所述参考类肿瘤共培养物被用作对照，优选地其中所述参考类器官共培养物或所述参考类肿瘤共培养物被用作阴性对照。
14.如权利要求8-13中任一项所述的方法，其中(i)所述类肿瘤共培养培养基和/或(ii)所述参考类器官共培养培养基或所述参考类肿瘤共培养培养基包含细胞外基质，优选地所述细胞外基质选自胶原蛋白或任何动物来源的或合成的基底膜基质。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述胶原蛋白是大鼠尾I型胶原蛋白。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述共培养物包含至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％或至少10％的胶原蛋白，优选地其中所述共培养物包含约10％(v/v)的胶原蛋白。
17.如权利要求8-16中任一项所述的方法，其中对于2％至10％的浓度，(i)所述类肿瘤共培养培养基和/或(ii)所述参考类器官共培养培养基或所述参考类肿瘤共培养培养基具有0.15mg/(ml)至0.95mg/(ml)的蛋白质浓度。
18.权利要求8、11或14-17中任一项所述的类肿瘤共培养培养基和/或类器官共培养培养基。
19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述类肿瘤共培养物和/或所述参考类器官共培养物和/或所述参考类肿瘤共培养物的免疫细胞具有至少40μm/天、60μm/天、80μm/天、100μm/天、120μm/天或140μm/天的运动性。
20.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述类肿瘤共培养物和/或所述参考类器官共培养物和/或所述参考类肿瘤共培养物中至少20％、至少30％、至少40％或至少50％的所述免疫细胞能够在80小时内移动至少200μm、至少250μm、至少300μm、至少350μm或至少400μm的距离。
21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞保持活性至少4h、8h、12h、24h、48h或72h。
22.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种候选试剂具有已知的
用于所述癌症的适宜性，并且所述方法还包括将所述一种或多种候选试剂鉴定为用于特定患者
的癌症的合适试剂。
23.如权利要求9-22中任一项所述的方法，其中所述类肿瘤共培养物和所述参考类器官共培养物或所述参考类肿瘤共培养物均来源于特定患者。
24.如权利要求22-23中任一项所述的方法，其中所述方法还包括用经鉴定为适合于所述特定患者的癌症的所述候选试剂所述患者。
25.如前述权利要求中任一项所述所述的方法，其中所述一种或多种候选试剂选自以下剂类别中的一种或多种：免疫剂、肿瘤特异性肽、检查点抑制剂、烷化剂、抗代谢物、代谢激动剂、代谢拮抗剂、植物生物碱、有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、放射剂、化学剂、抗体、光敏剂、干细胞移植物、疫苗、细胞毒性剂、细胞抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂、细胞因子、干扰素、白介素、嵌入剂、靶向剂、小分子药物、激素、类固醇、细胞剂、病毒载体和核酸剂。
26.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种候选试剂选自以下剂类别中的一种或多种：肿瘤特异性肽，检查点抑制剂、嵌合抗原受体(CAR)-T细胞剂、性TCR转基因T细胞和新抗原。
27.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种候选试剂是免疫剂。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述免疫剂是嵌合抗原受体(CAR)-T细胞剂、性TCR转基因T细胞或新抗原。
29.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述一种或多种候选试剂具有未知的用于癌症的适宜性，并且所述方法还包括将所述一种或多种候选试剂的子集鉴定为用于癌症的合适试剂。
30.如权利要求1-21或29中任一项所述的方法，其中所述一种或多种候选试剂具有已知的用于第一种癌症的适宜性和未知的用于第二种癌症的适宜性，并且所述方法还包括将所述一种或多种候选试剂的子集鉴定为用于所述第二种癌症的合适试剂。
31.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述癌症是上皮癌。宏欣
32.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述癌症是胃肠道癌。
33.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述癌症是结肠直肠癌。
34.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述癌症包括处于或低于II期、II级或T2N1M0之一的癌症。
35.如权利要求8-34中任一项所述的方法，其中所述肿瘤上皮细胞和/或所述正常上皮细胞获自来自癌症患者的样品。
36.如权利要求8-35中任一项所述的方法，其中所述肿瘤上皮细胞和所述正常上皮细胞获自同一癌症患者，任选地获自同一样品。
37.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品是组织活检物。
38.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组织活检物取自结肠直肠癌患者的经切除的结肠和/或直肠、结肠直肠癌或卵巢癌患者的腹水和/或肾癌患者的尿液。
39.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述肿瘤上皮细胞和/或所述正常上皮细胞选自：肺细胞、肝细胞、乳腺细胞、皮肤细胞、肠细胞、隐窝细胞、直肠细胞、胰腺细胞、内
分泌细胞、外分泌细胞、导管细胞、肾细胞、肾上腺细胞、甲状腺细胞、垂体细胞、甲状旁腺细胞、前列腺细胞、胃细胞、食管细胞、卵巢细胞、输卵管细胞或阴道细胞。
40.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述肿瘤上皮细胞和/或所述正常上皮细胞是肠细胞，例如结肠直肠细胞。
41.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述肿瘤上皮细胞和/或所述正常上皮细胞是上皮干细胞，优选为以Lgr5表达为特征的上皮干细胞。
42.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞包含选自以下的一种或多种细胞类型：上皮内淋巴细胞(IEL)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、外周血单个核细胞(PBMC)、外周血淋巴细胞(PBL)、T细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、αβT细胞、γδT细胞、B细胞、NK细胞和单核吞噬细胞。
43.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞获自来自癌症患者的样品。
44.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞获自外周血样品和/或组织活检物。
45.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述外周血淋巴细胞(PBL)和/或T细胞获自所述外周血样品。
46.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和/或上皮内淋巴细胞(IEL)分别获自肿瘤组织活检物或正常组织活检物。
47.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞与所述肿瘤上皮细胞和/或所述正常上皮细胞获自同一患者。
48.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞与所述类肿瘤和/或所述类器官是同种异体的，任选地其中所述免疫细胞与所述类肿瘤和/或类器官来源于不同患者或健康对照的外周血或组织活检物。
49.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞与所述类肿瘤和/或所述类器官是HLA匹配的。
50.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞在所述免疫细胞扩增培养基中存留至少4h、8h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h、192h、216h和240h。
51.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种类肿瘤和/或所述至少一种类器官包含自体细胞或由自体细胞组成。
52.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在与所述免疫细胞混合之前，将所述至少一种类肿瘤和/或所述至少一种类器官分离成共享一种或多种基因型、表型和/或表观遗传标志物的体。
53.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述基因型、表型和/或表观遗传标志物有助于(i)所述至少一种类肿瘤和/或至少一种类器官与(ii)所述免疫细胞之间的相互作用。
54.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述体共享HLA单倍型的存在或不存在，任选地其中所述HLA单倍型是HLA-A2。
55.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种类肿瘤或所述至少一种类器官包含哺乳动物细胞或由哺乳动物细胞组成，优选地所述哺乳动物细胞为人细胞。
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